异基因造血干细胞移植后cGVHD患者调节性B细胞数量和功能变化及机制研究

摘要

一、人CD19+CD24highCD38high及CD19+CD24highCD27+调节性B细胞特性的研究
　　目的：探讨人外周血CD19+CD24highCD38high及CD19+CD24highCD27+调节性B细胞的特性。
　　方法：流式细胞仪检测健康志愿者外周血单个核细胞中 CD19+CD24highCD38high及CD19+CD24highCD27+调节性B细胞（regulatory B cell, Breg）的比例及其凋亡、增殖、B细胞活化因子受体（B-cell activating factor receptor, BAFF-R）、跨膜蛋白活化因子钙离子信号调节亲环素配体(transmembrane activator calcium modulatorand cyclophilin ligand interactor, TACI)、B细胞成熟抗原(B cell maturation Ag, BCMA)、结合的B细胞活化因子(B-cell activating factor belonging to the TNF family, BAFF)及一种增殖诱导配体（a proliferation-inducing ligand, APRIL）水平、T细胞免疫球蛋白黏蛋白结构域相关分子-3（T cell Ig domain and mucin domain3, Tim-3）表达、CD20表达、CD80表达及 CD86表达。分别经 CD40L及 CpG ODN2006刺激后检测CD19+CD24highCD38high、CD19+CD24highCD27+Breg细胞分泌的IL-10、TGF-β水平。将CD19+CD24highCD38high与CD19+CD24highCD27+Breg细胞、CD19+CD24highCD38high与非Breg、CD19+CD24highCD27+与非Breg之间进行上述指标的比较。
　　结果：在正常人外周血单个核细胞中CD19+CD24highCD38high Breg比例为5.88％±3.18%，CD19+CD24highCD27+Breg的比例为14.10%±9.47%，CD19+CD24highCD27+Breg的比例高于CD19+CD24highCD38high Breg（P=0.000）。CD19+CD24highCD38high Breg与CD19+CD24highCD27+Breg相比凋亡水平无差异(28.87%±14.82% vs.28.84%±18.33%, P=0.994)，CD19+CD24highCD38high Breg与非CD19+CD24highCD38high细胞相比凋亡水平亦无差异(28.87%±14.82% vs.23.86%±11.17%, P=0.994)，而CD19+CD24highCD27+ Breg凋亡水平高于非 CD19+CD24highCD27+细胞(28.84%±18.33% vs.14.93%±7.83%, P=0.002)。 CD19+CD24highCD38high Breg与CD19+CD24highCD27+ Breg相比增殖水平差异无统计学意义(21.46%±11.88% vs.17.28%±13.18%, P=0.442)，CD19+CD24highCD38high Breg增殖水平高于非CD19+CD24highCD38high细胞(21.46%±11.88% vs.6.22%±10.07%, P=0.009)，CD19+CD24highCD27+Breg增殖水平与非CD19+CD24highCD27+细胞相比差异无统计学意义(17.28%±13.18%vs.12.96%±11.93%, P=0.570)。CD19+CD24highCD38high Breg细胞与CD19+CD24highCD27+Breg细胞均表达BAFF-R、TACI、BCMA，并且两群细胞间BAFF-R、TACI、BCMA的表达差异无统计学意义(BAFF-R：97.17%±6.17%vs.96.46%±8.64%, P=0.743; TACI:65.84%±28.60% vs.71.43%±36.51%, P=0.558;BCMA:91.15%±9.62%vs.90.28%±13.61%, P=0.799)。CD19+CD24highCD38high Breg细胞BAFF-R、TACI的表达高于非CD19+CD24highCD38high细胞(97.17%±6.17%vs.89.56%±7.43%、65.84%±28.60%vs.39.07%±23.92%, P=0.000、0.002),而BCMA的表达(94.13%±3.15%)无差异(P=0.495)。CD19+CD24highCD27+ Breg细胞BAFF-R、TACI、BCMA的表达与非 CD19+CD24highCD27+细胞(98.71%±1.10%、56.14%±28.75%、94.50%±4.08%)相比差异均无统计学意义(P=0.142,0.130,0.481)。CD19+CD24highCD38high Breg细胞与 CD19+CD24highCD27+ Breg细胞结合BAFF、APRIL的水平差异均无统计学意义(55.24%±17.46% vs.54.42%±20.36%, P=0.882;61.95%±31.66% vs.63.97%±35.07%, P=0.835)。CD19+CD24highCD38high Breg细胞结合BAFF的水平与非CD19+CD24highCD38high细胞相比差异无统计学意义(55.24%±17.46% vs.58.95%±12.59%，P=0.424),而结合 APRIL的水平高于非CD19+CD24highCD38high细胞(55.24%±17.46% vs.35.29%±22.08%, P=0.002)。CD19+CD24highCD27+Breg细胞与非CD19+CD24highCD27+细胞相比结合BAFF、APRIL的水平(59.05%±15.89%，57.76%±33.04%)差异均无统计学意义(P=0.404,0.546)。CD19+CD24highCD38high Breg细胞 Tim-3表达水平高于 CD19+CD24highCD27+ Breg(14.27%±6.97%vs.6.91%±5.88%, P=0.014)，CD19+CD24highCD38high Breg细胞Tim-3表达水平高于非 CD19+CD24highCD38high细胞(14.27%±6.97% vs.1.44%±1.71%, P=0.000)，CD19+CD24highCD27+Breg细胞Tim-3表达水平高于非CD19+CD24highCD27+细胞(6.91%±5.88% vs.1.99%±2.01%, P=0.002)。CD19+CD24highCD38high Breg与CD19+CD24highCD27+Breg相比CD20表达水平差异无统计学意义(96.89%±7.90%vs.97.12%±5.44%, P=0.912)，CD19+CD24highCD38high Breg细胞CD20表达水平高于非 CD19+CD24highCD38high细胞(88.67%±9.22%, P=0.004)，CD19+CD24highCD27+Breg细胞CD20表达水平与非CD19+CD24highCD27+细胞(96.76%±3.38%)相比差异无统计学意义(P=0.798)。经 CD40L刺激后分泌 IL-10、 TGF-β的CD19+CD24highCD38high Breg细胞比例(7.81%±2.67%,7.05%±2.66%)与CD19+CD24highCD27+Breg(7.17%±2.47%,8.14%±2.44%)相比差异均无统计学意义(P=1.000,0.404)。经 CpG ODN2006刺激后分泌 IL-10、 TGF-β的CD19+CD24highCD38high Breg细胞比例(10.13%±12.19%,7.38%±2.98%)与CD19+CD24highCD27+Breg(9.88%±6.48%,9.03%±3.75%)相比差异均无统计学意义(P=0.421,0.763)。CD19+CD24highCD38high Breg与CD19+CD24highCD27+Breg相比CD80表达水平差异无统计学意义(90.01%±8.78% vs.83.62%±16.51%, P=0.113)，CD19+CD24highCD38high Breg细胞CD80表达水平高于非CD19+CD24highCD38high细胞(66.78%±17.32%, P=0.000)，CD19+CD24highCD27+Breg细胞 CD80表达水平与非CD19+CD24highCD27+细胞相比差异无统计学意义(84.42%±16.89%, P=0.690)。CD19+CD24highCD38high Breg与CD19+CD24highCD27+Breg相比CD86表达水平差异无统计学意义(89.31%±11.00%vs.89.49%±10.87%, P=0.515)，CD19+CD24highCD38high Breg细胞 CD86表达水平高于非 CD19+CD24highCD38high细胞(85.37%±13.64%, P=0.000)，CD19+CD24highCD27+Breg细胞CD86表达水平与非CD19+CD24highCD27+细胞相比差异无统计学意义(89.63%±10.74%, P=0.546)。
　　结论：在正常人外周血单个核细胞中 CD19+CD24highCD27+ Breg的比例高于CD19+CD24highCD38high Breg。 CD19+CD24highCD27+ Breg凋亡水平高于非CD19+CD24highCD27+细胞。 CD19+CD24highCD38high Breg增殖水平高于非CD19+CD24highCD38high细胞。CD19+CD24highCD38high Breg与 CD19+CD24highCD27+Breg细胞 BAFF-R、TACI、BCMA的表达及结合的BAFF、APRIL均无差异。CD19+CD24highCD38high Breg细胞 BAFF-R、 TACI的表达高于非CD19+CD24highCD38high细胞。CD19+CD24highCD38high Breg结合APRIL的水平高于非CD19+CD24highCD38high细胞。CD19+CD24highCD38high Breg细胞Tim-3表达水平高于CD19+CD24highCD27+Breg，并且二者均高于非Breg细胞。CD19+CD24highCD38high Breg与 CD19+CD24highCD27+ Breg分泌 IL-10、 TGF-β的水平无差异。CD19+CD24highCD38high Breg与 CD19+CD24highCD27+ Breg均表达 CD20。CD19+CD24highCD38high Breg细胞 CD80、 CD86表达水平高于非CD19+CD24highCD38high细胞。
　　二、cGVHD患者 CD19+CD24highCD38high及 CD19+CD24highCD27+调节性B细胞数量变化及机制研究
　　目的：探讨异基因造血干细胞移植后 cGVHD患者 CD19+CD24highCD38high、CD19+CD24highCD27+调节性B细胞数量变化及相关机制。
　　方法：流式细胞仪检测轻-中度cGVHD患者、重度cGVHD患者、无cGVHD患者、免疫耐受者及健康志愿者外周血单个核细胞中 CD19+CD24highCD38high、CD19+CD24highCD27+Breg细胞的比例及其凋亡、增殖、BAFF-R、TACI、BCMA、结合的BAFF及APRIL水平。酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组患者血浆中BAFF、APRIL水平。依据血常规淋巴细胞计数及流式细胞仪检测CD19+CD24highCD38high及CD19+CD24highCD27+Breg细胞的比例计数其绝对数。进行各组间比较。
　　结果：轻-中度 cGVHD组 B细胞绝对数[(3.83±2.20)×107/L]、CD19+CD24highCD38high Breg细胞绝对数[(13.31±13.53)×102/ml]、CD19+CD24highCD27+ Breg细胞绝对数[(27.68±32.88)×102/ml]、CD19+CD24highCD38high Breg细胞比例(3.45%±1.75%)、CD19+CD24highCD27+Breg细胞比例(2.43%±1.42%)均低于无 cGVHD组的(10.85±10.40)×107/L、(87.36±106.40)×102/ml、(57.59±61.85)×102/ml、6.26%±3.23%、5.06%±3.48%(P<0.05)。轻-中度cGVHD组CD19+CD24highCD38high Breg细胞凋亡(48.40%±19.15%)、血浆BAFF水平[(2877.90±248.76) ng/L]、CD19+CD24highCD38high Breg细胞结合的BAFF水平(67.84%±19.12%)均高于无cGVHD组的22.23%±12.05%、(2495.60±386.78) ng/L、60.76%±18.90%(P<0.05)。重度cGVHD组CD19+CD24highCD38high Breg细胞凋亡(72.34%±19.20%)、血浆 BAFF水平[(3171.60±328.50) ng/L]、血浆BAFF/CD19+CD24highCD38high Breg细胞数的比值(15756.00±25144.61)、血浆BAFF/CD19+CD24highCD27+ Breg细胞数的比值(8103.10±12623.27)、血浆APRIL/CD19+CD24highCD38high Breg细胞数的比值(16.35±32.03)、血浆APRIL/CD19+CD24highCD27+ Breg细胞数的比值(8.53±12.05)、CD19+CD24highCD38high Breg细胞 TACI表达水平(93.36%±9.76%)、CD19+CD24highCD38high Breg细胞结合的BAFF水平(79.12%±19.62%)、CD19+CD24highCD27+ Breg细胞结合的BAFF水平(79.27%±18.57%)、CD19+CD24highCD38high Breg细胞上结合的APRIL水平(87.64%±23.69%)均高于无cGVHD组(P<0.05)。重度 cGVHD组 B细胞绝对数[(2.58±3.75)×107/L]、CD19+CD24highCD38high Breg细胞绝对数[(2.97±5.89)×102/ml]、CD19+CD24highCD27+Breg细胞绝对数[(7.24±11.27)×102/ml]、CD19+CD24highCD38high Breg细胞比例(0.70%±0.40%)、 CD19+CD24highCD27+ Breg细胞比例(2.22%±0.87%)、CD19+CD24highCD38high Breg细胞增殖水平(2.02%±1.68%)、CD19+CD24highCD27+Breg细胞增殖(4.09%±2.44%)均低于无 cGVHD组(P<0.05)。重度 cGVHD组CD19+CD24highCD38high Breg细胞比例、CD19+CD24highCD38high Breg细胞增殖水平均低于轻-中度cGVHD组(P<0.05)。重度cGVHD组CD19+CD24highCD38high Breg细胞凋亡、血浆BAFF水平、血浆BAFF/CD19+CD24highCD38high Breg细胞数的比值、血浆 BAFF/CD19+CD24highCD27+ Breg细胞数的比值、血浆APRIL/CD19+CD24highCD38high Breg细胞数的比值、血浆APRIL/CD19+CD24highCD27+Breg细胞数的比值、CD19+CD24highCD38high Breg细胞上结合的BAFF水平、CD19+CD24highCD27+ Breg细胞结合的BAFF水平均高于轻-中度 cGVHD组(P<0.05)。免疫耐受组 B细胞绝对数[(13.30±15.84)×107/L]、CD19+CD24highCD38high Breg细胞绝对数[(168.05±220.05)×102/ml]、CD19+CD24highCD38high Breg细胞比例(11.40%±7.94%)、CD19+CD24highCD27+ Breg细胞凋亡(47.91%±20.39%)、CD19+CD24highCD38high Breg细胞增殖(33.75%±13.47%)、血浆BAFF水平[(3152.80±752.48) ng/L]、血浆APRIL水平[(87.68±19.32) ng/L]、CD19+CD24highCD38high Breg细胞上结合的BAFF水平(68.16%±17.46%)、CD19+CD24highCD38high Breg细胞上结合的APRIL水平(81.89%±21.98%)均高于正常对照组的(4.68±2.96)×107/L、(27.48±24.99)×102/ml、5.88%±3.18%、28.84%±18.33%、21.46%±11.88%、(2218.80±229.32) ng/L、(69.83±10.27) ng/L、55.24%±17.46%、61.95%±31.66%(P<0.05)。免疫耐受组 CD19+CD24highCD27+ Breg细胞绝对数[(42.11±33.25)×102/ml]、CD19+CD24highCD27+Breg细胞比例(4.14%±2.21%)、CD19+CD24highCD38high Breg细胞凋亡(15.18%±14.48%)、CD19+CD24highCD27+Breg细胞增殖(7.01%±5.62%)均低于正常对照组的(90.48±57.31)×102/ml、14.10%±9.47%、28.87%±14.82%、17.26%±13.18%(P<0.05)。无cGVHD组B细胞绝对数、CD19+CD24highCD27+Breg细胞凋亡(54.49%±21.29%)、血浆APRIL水平、CD19+CD24highCD38high Breg细胞上结合的BAFF水平、CD19+CD24highCD38high Breg细胞上结合的APRIL水平、CD19+CD24highCD27+Breg细胞上结合的APRIL水平均高于正常对照组(P<0.05)。无cGVHD组CD19+CD24highCD27+Breg细胞绝对数、CD19+CD24highCD27+Breg细胞比例、CD19+CD24highCD38high Breg细胞凋亡低于正常对照组(P<0.05)。免疫耐受组CD19+CD24highCD38high Breg细胞绝对数、CD19+CD24highCD38high Breg细胞比例、血浆BAFF水平均高于无cGVHD组(P<0.05)。免疫耐受组CD19+CD24highCD27+ Breg细胞 TACI表达水平(58.50%±28.08%)低于无 cGVHD组的78.18%±28.75%(P<0.05)。各组间 CD19+CD24highCD38high Breg、CD19+CD24highCD27+ Breg细胞BAFF-R、BCMA表达水平无差异(P<0.05)。
　　结论：异基因造血干细胞移植后 cGVHD患者同无 cGVHD者相比CD19+CD24highCD38high Breg、CD19+CD24highCD27+ Breg细胞数量减低，且在重度cGVHD患者中CD19+CD24highCD38high Breg数量低于轻-中度cGVHD。在免疫耐受者中CD19+CD24highCD38high Breg数量较正常对照升高，但CD19+CD24highCD27+ Breg细胞数量较正常对照减低。Breg细胞数量的变化与BAFF、APRIL及其受体变化所致凋亡和增殖水平的变化有关。
　　三、cGVHD患者 CD19+CD24highCD38high及 CD19+CD24highCD27+调节性B细胞功能变化及机制研究
　　目的：探讨异基因造血干细胞移植后 cGVHD患者 CD19+CD24highCD38high、CD19+CD24highCD27+调节性B细胞功能变化及相关机制。
　　方法：流式细胞仪检测轻-中度cGVHD患者、重度cGVHD患者、无cGVHD患者、免疫耐受者及健康志愿者外周血单个核细胞中 CD19+CD24highCD38high及CD19+CD24highCD27+Breg细胞分别经CD40L及CpG ODN2006刺激后分泌IL-10、TGF-β水平，同时检测STAT3磷酸化(pSTAT3)、MyD88、CD40、TLR9、CD80、CD86及Tim-3水平，并进行各组间比较。
　　结果：经CD40L刺激后轻-中度cGVHD、重度cGVHD患者CD19+CD24highCD38high Breg细胞分泌IL-10的水平(2.32%±0.42%、0.56%±0.54%)均低于无cGVHD者(5.88%±3.11%)(P＜0.05)，TGF-β水平各组间无差异；重度 cGVHD患者CD19+CD24highCD27+Breg细胞分泌IL-10的水平(2.02%±1.90%)低于无cGVHD者(4.94%±3.81%)(P＜0.05)，TGF-β水平各组间无差异。经 CpG ODN2006刺激后CD19+CD24highCD38high Breg细胞分泌 IL-10、TGF-β的水平均无差异；轻-中度cGVHD、重度cGVHD患者CD19+CD24highCD27+Breg细胞分泌IL-10的水平(4.02%±1.91%、1.69%±1.25%)均低于无cGVHD者(8.80%±5.98%)(P＜0.05)，TGF-β水平各组间无差异。轻-中度cGVHD、重度cGVHD患者CD19+CD24highCD38high Breg细胞pSTAT3水平(6.48%±10.20%、3.06%±4.80%)均低于无cGVHD者(14.79%±7.05%)(P＜0.05)； MyD88水平各组间无差异。重度 cGVHD患者CD19+CD24highCD27+Breg细胞 pSTAT3、MyD88水平(3.31%±2.09%，41.31%±29.52%)均低于无 cGVHD者(27.98±12.65,69.41%±24.09%)(P＜0.05)。重度cGVHD患者 CD19+CD24highCD38high、CD19+CD24highCD27+Breg细胞 Tim-3水平(2.07%±0.58%、2.59%±2.44%)均低于无cGVHD者(11.35%±9.72%，16.34%±22.52%)(P＜0.05)。免疫耐受者CD19+CD24highCD27+Breg细胞Tim-3水平(23.49%±23.19%)高于正常对照(6.91%±5.88%)(P＜0.05)。CD19+CD24highCD38high、CD19+CD24highCD27+Breg细胞CD40、TLR9、CD80、CD86水平各组间均无差异。
　　结论：异基因造血干细胞移植后 cGVHD患者与无 cGVHD者相比CD19+CD24highCD38high、CD19+CD24highCD27+Breg细胞分泌IL-10的功能减弱，分泌 TGF-β的功能无异常。CD19+CD24highCD38high Breg功能的减弱与 CD40介导的STAT3信号转导通路上pSTAT3水平减低有关。CD19+CD24highCD27+Breg分泌IL-10的功能的减弱与CD40介导的STAT3信号转导通路上pSTAT3水平减低及TLR9介导的MyD88信号转导通路上MyD88水平减低均有关。cGVHD患者与无cGVHD者相比CD19+CD24highCD38high、CD19+CD24highCD27+Breg细胞Tim-3表达减低，而在免疫耐受者CD19+CD24highCD27+Breg细胞Tim-3表达较正常对照升高。
　　四、对cGVHD具有生物标记意义的B细胞相关基因筛选
　　目的：筛选对cGVHD具有生物标记意义的B细胞相关基因。
　　方法：利用基因芯片方法分别对轻-中度 cGVHD患者、重度 cGVHD患者、无cGVHD患者、免疫耐受者及健康志愿者外周血单个核细胞的基因表达谱进行检测，进行组间比较，筛选出与B细胞相关的差异表达基因。应用荧光定量PCR对筛选出的差异表达基因进行验证。
　　结果：基因芯片结果显示cGVHD患者与无cGVHD患者相比共有284条表达差异基因，其中与B细胞相关的有5条,分别为CDKN2A、SOX4、ZBTB32、CD70、IL21R。免疫耐受患者与无cGVHD患者相比共有800条表达差异基因，其中与B细胞相关的有3条,分别为NFAM1、CD27、BST1。应用荧光定量PCR对基因芯片筛选出的表达差异基因进行验证，结果显示 cGVHD患者与无 cGVHD患者相比CDKN2A基因的表达水平降低(P=0.001)。免疫耐受患者与无cGVHD患者相比CD27基因的表达水平升高(P=0.038)，而BST1基因的表达水平减低(P=0.022)
　　结论：cGVHD患者与无cGVHD患者相比CDKN2A基因的表达水平降低。免疫耐受患者与无cGVHD患者相比CD27基因的表达水平升高，而BST1基因的表达水平减低。这些基因的变化有望成为具有潜在生物标记意义的指标用于指导临床工作。

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引言

参考文献

技术路线

第一部分：人CD19+CD24highCD38high及CD19+CD24highCD27+调节性B细胞特性的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分： cGVHD患者CD19+CD24highCD38high、CD19+CD24highCD27+调节性B细胞数量变化及机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分： cGVHD患者CD19+CD24highCD38high、CD19+CD24highCD27+调节性B细胞功能变化及机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第四部分：对cGVHD具有生物标记意义的B细胞相关基因筛选

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

结论

综述：调节性B细胞与免疫相关性疾病的关系

攻读学位期间公开发表的论文

攻读学位期间科研立项及所获奖项

缩略词表

参考文献