电离辐射在皮肤成纤维细胞WS1中诱导旁效应的应答机制研究

摘要

目的：
　　电离辐射诱导的旁效应指的是未受照射细胞在接受照射细胞传递的信号后产生的生物学变化。包括旁效应在内的非标靶效应改变了放射生物学的传统理论而成为广为接受的新教义。旁效应的发生在低剂量辐射健康风险的评估、放疗的疗效及对正常组织的损伤等方面可能具有重要作用，因此已成为放射生物学领域的一个研究热点。目前关于旁效应的研究主要集中在其发生的分子机制以及对机体造成的影响等方面。从旁效应发生的过程来看，它包括信号细胞受照后启动关键的信号通路，然后释放旁效应信号，最后受体细胞接受旁效应信号产生生物学变化。本研究的主要目的是从受体细胞的角度来研究旁效应发生的分子机制。具体说来，首先要验证X射线是否可以在人胚胎皮肤成纤维细胞WS1中诱导经培养液介导的旁效应现象；然后进一步探究受α粒子照射的HaCat角质细胞与未受照射的WS1细胞共培养后，WS1细胞是否会发生旁效应，如果发生那么WS1细胞的应答机制又是什么，最后用HaCat细胞和WS1细胞简单模拟构建人皮肤组织模型，为在半体内进一步深入研究电离辐射旁效应奠定基础。
　　方法：
　　本研究采用条件培养液转移和共培养两种方法研究培养液介导的电离辐射旁效应。辐射方式包括X射线和α粒子。在第一部分中，以微核形成、DNA损伤（53BP1 foci）、细胞凋亡、增殖、活性氧水平和miR-21等指标确证X射线在WS1细胞中诱导经条件培养液介导的旁效应；另用ELISA法定量检测了条件培养液中TGF-β1含量的变化；第二部分主要是采用克隆形成实验和53BP1 foci免疫荧光实验对本实验室自行设计的用于细胞生物学实验的新型α粒子照射装置进行验证。在第三部分中，以ROS水平和53BP1 foci为指标检测与受α粒子照射的角质细胞HaCat共培养的人皮肤成纤维细胞WS1发生的旁效应。更重要的是，采用细胞转染改变WS1细胞miR-21的表达水平或通过外源性增加细胞SOD2的水平来细致地研究了旁效应细胞中的miR-21和SOD2在旁效应发生中的重要作用。第四部分，以鼠尾胶原蛋白为基质，将人胚胎皮肤成纤维细胞WS1和人永生化角质细胞HaCat进行立体结构培养，简单模拟人体皮肤组织的构成，并通过HE和免疫组化染色验证三维组织的成功构建。
　　结果：
　　1. X射线可在WS1细胞中诱导经培养液介导的旁效应。与新鲜培养液（Ctr）和未受照射条件培养液（SCM）对照组相比较，用1 Gy X射线照射后3小时的WS1细胞条件培养液（3 h RCM）处理未受照射的WS1细胞30分钟后，旁效应细胞中ROS水平可升高11％；3 h RCM处理旁效应细胞1小时后，53BP1 foci阳性细胞率增加了38%；3 h RCM处理旁效应细胞3小时后，旁效应细胞中miR-21的表达水平增加了1.38倍；3 h RCM处理旁效应细胞24小时后，微核形成率增加了44%，凋亡增加近一倍。此外还发现，与3 h SCM相比，3 h RCM中TGF-β1的含量增加了18%。在共培养条件下，发现受照细胞与未受照细胞共培养1 h后旁效应细胞53BP1 foci的阳性细胞率增加了46%；共培养24 h后，旁效应细胞WS1中微核形成率增加了34%。
　　2.自行设计的α粒子照射装置可以用于生物实验的研究。该装置的计算模拟剂量率为0.14 Gy/min。以WS1细胞克隆率为指标，计算得出在细胞存活率为0.5时，α粒子相对于160 KeV的X射线的相对生物学效应为1.71。以53BP1 foci为指标检测直接受α粒子照射的WS1细胞DNA损伤情况，发现分别照射0.28 Gy、0.56 Gy后可使53BP1 foci阳性细胞数分别增加0.38倍和1倍，并且显示出DNA损伤的非均一性。
　　3.受α粒子照射的HaCat角质细胞可在未受照WS1细胞中诱导经培养液介导的旁效应，并且WS1旁效应细胞中的miR-21和SOD2对旁效应的产生起着非常重要的调控作用。未受照射的旁效应细胞WS1与受照射的信号细胞HaCat共培养30分钟后，WS1细胞中ROS水平上升了15%；共培养3小时后，53BP1 foci(DNA损伤常用标记）增加了1.4倍，表明与照射过的角质细胞HaCat共培养后，旁效应细胞WS1中发生了氧化应激和DNA损伤。并且，与受照HaCat细胞共培养3小时后，旁效应细胞WS1中miR-21的表达水平升高，而在WS1细胞中下调miR-21水平可使旁效应现象消除，而仅仅单独过表达miR-21就可诱导与旁效应类似的氧化应激和DNA损伤。这些数据表明，本系统中，miR-21在旁效应的调控中起着重要作用。另外，MnSOD（SOD2）也参与了对WS1细胞旁效应的调控，过表达SOD2可解除旁效应诱导的氧化应激和DNA损伤，提示SOD2在电离辐射诱导旁效应的发生中可起到重要作用。另外，本研究还发现miR-21可调控SOD2。
　　4.构建人皮肤组织三维模型。利用人胚胎皮肤成纤维细胞WS1和人永生化角质细胞HaCat构建了一个多细胞体系实验模型，从而简单地模拟了人体正常皮肤组织结构。HE染色结果显示HaCat细胞分化为层状结构；在X射线照射后，免疫组化染色显示的53BP1 foci证实三维皮肤组织中细胞的DNA损伤。除此之外还构建了稳定表达SOD2的WS1细胞株，进而可用稳定表达SOD2的WS1细胞与HaCat细胞构建三维皮肤模型。
　　结论：
　　本研究证实X射线可在WS1细胞中诱导经培养液介导的旁效应。并且WS1细胞还可接受受α粒子照射的HaCat细胞释放的旁效应信号从而产生旁效应。从未受照射细胞的视角来看，WS1细胞中的miR-21和SOD2对旁效应的发生起着至关重要的作用，而且miR-21可能通过对SOD2的调控来调控着旁效应的发生。具体说来，受照细胞HaCat传递的旁效应信号可上调旁效应细胞WS1的miR-21，而上调的miR-21再下调SOD2的表达从而导致WS1细胞出现氧化应激和DNA损伤的旁效应现象。最后，本研究成功构建了三维皮肤组织，为下一步在半体内深入研究旁效应的机制奠定了基础。

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引言

第一部分X射线在WS1细胞中诱导产生旁效应

材料

方法

结果

讨论

第二部分用于细胞生物学实验的新型α粒子照射装置的验证

材料

方法

结果

讨论

第三部分细胞共培养模型中受α粒子照射的HaCat细胞在WS1细胞中诱导旁效应的应答机制研究

材料

方法

结果

讨论

第四部分人皮肤组织三维模型的构建

材料

方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述: 电离辐射的表观遗传学调控及其在旁效应中的研究进展

攻读学位期间本人出版或公开发表的论文

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