BmNPVOrf98a和Orf99基因的功能及与p74基因重叠sORF的确认

摘要

杆状病毒是一类具有高度特异性宿主要求的节肢动物病毒。随着科学研究的日趋深入，杆状病毒在外源基因的表达、基因治疗载体以及新型杀虫剂等方面都取得重要研究进展。目前杆状病毒研究最为透彻的是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autogarpha californica nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）和家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)。通过基因缺失研究，杆状病毒许多基因的基本功能已探明，但仍有部分基因的功能未明，特别是一些编码蛋白分子量小于100氨基酸残基的小开放读码框(Small open reading frame,sORF)，本研究选取了BmNPV中BmOrf98a、BmOrf99两个未知功能的基因为研究对象，运用Red重组系统对BmOrf98a和BmOrf99分别进行了敲除，通过比较敲除型重组病毒和野生型病毒在病毒形态发生、病毒增殖复制等方面的差异，基本明确了BmOrf98a和BmOrf99基因的功能，进一步丰富了BmNPV的分子生物学研究内容；另外，我们新预测到了一个sORF，该sORF与BmNPV P74基因重叠，并通过实验证明新预测的sORF能编码蛋白，为BmNPV基因家族提供了新的成员：
　　1、BmOrf98a基因功能的研究
　　BmOrf98a基因位于BmNPV基因组94474-94647nt之间，ORF全长174bp,编码57个氨基酸,预计分子量为6702Da。同源搜寻结果显示,在GenBank已登录的杆状病毒全基因组序列中有BmNPV、AcMNPV以及野桑蚕(Bombyx mandarina) NPV具有编码BmOrf98a的同源基因，不同BmNPV间BmOrf98a氨基酸序列的一致性达98-100％，BmNPV与AcMNPV间的同源性达91%。
　　转录时相分析结果显示，BmOrf98a是一个晚期基因；通过Red重组系统构建敲除型病毒BmNPV-BmOrf98aKO-polh-GFP，修复型病毒BmNPV-BmOrf98aRE-polh-GFP和野生型病毒BmNPV-BmOrf98aWT-polh-GFP，并将敲除型病毒BmNPV-BmOrf98aKO-polh-GFP和野生型病毒BmNPV-BmOrf98aWT-polh-GFP DNA分别转染BmN细胞。结果显示，敲除BmOrf98a病毒仍能够增殖复制，病毒DNA转染后6-24h，敲除型病毒转染细胞培养上清BV水平与对照病毒BmNPV-BmOrf98aWT-polh-GFP无明显差别；转染72h后，前者细胞培养上清BV水平减低略低于对照病毒转染细胞;但转染后72h，二者之间培养细胞上清的TCID50无明显差别；而病毒DNA的复制水平敲除型病毒和对照病毒BmNPV-BmOrf98aWT-polh-GFP间无明显差异。透射电镜观察显示，BmOrf98a敲除对病毒粒子装配和多角体形成无明显影响。敲除型病毒感染72 h后，与BmOrf98a基因3’-端部分重叠但位于病毒DNA另一条链上的BmOrf99在培养细胞中的表达水平比对照组提高2.61倍。这些结果表明，BmOrf98a为病毒复制非必须，缺失对病毒DNA复制、BV水平、病毒形态发生无明显影响，但可以上调与其重叠基因BmOrf99基因的表达水平。
　　2、BmOrf99基因功能的研究
　　BmOrf99基因位于BmNPV基因组94540-94725nt之间，ORF为186bp，编码61个氨基酸，理论分子量为7100 Da。同源搜寻结果显示，在登录的杆状病毒全基因组序列中，仅有8种杆状病毒含有BmOrf99的同源基因；同源性比对分析发现，BmNPV Orf99与野桑蚕NPV、灰色尺蠖蛾NPV、苜蓿银纹夜蛾核NPV的相应蛋白有较高的同源性，与其他杆状病毒的蛋白几乎无同源性，基于氨基酸序列的进化分析结果显示，BmOrf99和中国野桑蚕NPV的类Ac122蛋白亲缘关系最接近。暗示该基因并不是核型多角体病毒中的功能性保守基因，并不是不可或缺的。
　　转录时相分析表明BmOrf99是一个早期基因。通过Red重组系统构建敲除型病毒BmNPV-BmOrf99KO-polh-GFP,修复型病毒BmNPV-BmOrf99RE-polh-GFP和野生型病毒 BmNPV-BmOrf99WT-polh-GFP。并将敲除型病毒BmNPV-BmOrf99KO-polh-GFP和野生型病毒BmNPV-BmOrf99WT-polh-GFP DNA分别转染BmN细胞。转染结果显示，敲除BmOrf99病毒仍能增殖复制，透射电镜观察显示，BmOrf99敲除对病毒粒子装配和多角体形成无明显影响。病毒DNA转染后24-72h，敲除型病毒转染细胞培养上清BV水平略高于对照病毒BmNPV-BmOrf99WT-polh-GFP；转染后72h，前者细胞培养上清TCID50略高于后者；转染6-72 h，敲除型病毒转染细胞中病毒DNA水平高于对照病毒转染细胞；敲除型病毒感染72 h后，细胞中BmOrf98a表达水平比对照组提高2.21倍。这些结果表明，BmOrf99为病毒复制非必须，缺失可促进病毒DNA复制，略增加BV水平，但对病毒形态发生无影响，BmOrf99有可能通过调节病毒其他基因的表达而发挥作用。
　　3、与P74基因重叠的sORF的确认
　　在BmNPV P74基因中，经预测可能存在一个编码37个氨基酸残基的sORF(110245nt-110355nt)(Bmp74sORF)，将其DNA序列克隆进原核表达载体pEasy，转化大肠杆菌Transetta(DE3)，用IPTG进行诱导表达，SDS-PAGE和Western blotting检测结果显示，BmOrfP74sORF获得了表达；利用重组蛋白免疫小鼠，制备了抗BmP74 sORF多抗。细胞免疫荧光结果显示，Bmp74 sORF确为一小肽编码基因，表达产物主要定位在BmN细胞的细胞核中。转录时相进行分析结果表明Bmp74sORF为早期基因。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第一章 文献综述

1.1杆状病毒概述

1.2杆状病毒的分类学地位

1.3杆状病毒的形态结构

1.4杆状病毒的生活史

1.5杆状病毒基因组的研究

1.6 杆状病毒基因的表达调控

1.7杆状病毒的应用

1.8昆虫杆状病毒表达系统

1.9 Red重组系统的概述原理及应用

参考文献

第二章 研究目的与内容

1.研究的目的与意义

2、研究的主要内容

3、主要技术路线

第三章 家蚕核型多角体病毒 BmOrf98a基因的功能研究

1 材料与方法

2.结果与分析

3讨论

参考文献

第四章 家蚕核型多角体病毒 BmOrf99基因功能的研究

1 材料与方法

2.结果与分析

3讨论

参考文献

第五章 家蚕核型多角体病毒p74 sORF的确认

1材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

结论

1．已取得的成果

2．有待进一步研究的问题

在校期间发表论文情况

附录

致谢