鲤疱疹病毒ⅡORF90和ORF99基因的原核表达及多克隆抗体的制备

摘要

根据本实验室获得的鲤疱疹病毒Ⅱ(CyHV-2)基因组序列，设计特异性引物，通过PCR扩增ORF90、ORF99基因片段，分别克隆至pGEX-KG和pProHTb原核表达载体，成功构建了pGEX-KG-ORF90和pProHTb-ORF99重组子。转化大肠杆菌BL21宿主菌，经IPTG诱导，分别获得了分子量约为56kD和47KD的重组蛋白。SDS-PAGE分析表明 ORF90重组蛋白少量为可溶性蛋白，多以包涵体的形式存在。ORF99重组蛋白则以包涵体存在。纯化的重组蛋白均具有较好的ELISA反应性。进一步将ORF90和 ORF99重组蛋白经包涵体纯化后免疫新西兰大白兔制备了 ORF90和ORF99重组蛋白的多克隆抗体。通过western-blot检测其抗体效价，结果表明两个多抗在1：100000的稀释倍数下仍可产生免疫印迹。以免疫组化对制备的多克隆抗体进行检测，anti-ORF90抗体在中肾组织的肾小管上皮细胞质中出现阳性信号，anti-ORF99抗体在中肾组织的肾小管上皮细胞质及细胞核中均出现阳性信号，证实所得的抗体可用于免疫组化研究，为建立检测 CyHV-2抗体和抗原的诊断方法、相关蛋白功能检测等研究奠定了基础。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1鲤疱疹病毒II的生物学特征

1.2鲤疱疹病毒II的流行特点

1.2.1宿主范围

1.2.2传播途径

1.2.3发病温度

1.3国内外流行情况

1.4鲤疱疹病毒II的基因组结构

1.5临床症状及病理特征

1.6.1细胞培养技术

1.6.2电子显微技术

1.6.3分子生物学技术

1.6.4免疫学技术

1.7研究目的与意义

第二章ORF90、ORF99基因的原核表达及多克隆抗体的制备

2.1材料与方法

2.1.1CyHV-2毒株的来源

2.1.2试剂和溶液

2.1.3实验仪器

2.1.4 ORF90、ORF99基因编码蛋白的生物信息学分析

2.1.5 ORF90、ORF99基因的引物设计与合成

2.1.6患病鲫肾组织DNA提取

2.1.7 ORF90、ORF99基因的扩增及琼脂糖凝胶纯化回收

2.1.8 ORF90和0RF99基因与pGEX-KG、pProHTb载体的双酶切与纯化回收

2.1.9构建pGEX-KG-ORF90和pProHTb-ORF99原核表达质粒

2.1.10重组质粒的双酶切鉴定

2.1.11重组表达菌的诱导表达

2.1.12表达产物的可溶性分析

2.1.13 融合蛋白ORF90和ORF99多克隆抗体的制备

2.1.14 Western-Blotting检测抗体效价

2.2结果与分析

2.2.1 ORF90、ORF99基因编码蛋白的生物信息学分析

2.2.2目的基因扩增与表达质粒构建

2.2.3 ORF90蛋白的诱导表达与可溶性分析

2.2.4 ORF99蛋白的诱导表达与可溶性分析

2.2.5 Western-Blot检测抗体效价

2.3讨论

第三章 ORF90和ORF99重组蛋白及其抗体的初步应用

3.1材料与方法

3.1.1实验材料：

3.1.2实验试剂

3.1.3实验仪器

3.1.4 ORF90重组蛋白的亲和纯化

3.1.5 ORF99融合蛋白的纯化

3.1.6免疫组化分析

3.1.7间接ELISA方法

3.2结果与分析

3.3.1融合蛋白的纯化

3.2.2 ORF90和ORF99重组蛋白ELISA反应性分析

3.2.3抗ORF90和ORF99抗体用于免疫组化的评价

3.3讨论

参考文献

致谢