锦鲤疱疹病毒ORF72和TK基因原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

摘要

国内外对锦鲤疱疹病毒有很多的检测方法的报道，多为PCR的检测，却少见免疫学检测方法。PCR虽然具有高灵敏度的优点，但由于存在假阳性，在结果判定上常常会出现不确定性，并且难以判断是否有完整病毒粒子还是仅存在残余的病毒核酸。因此建立有效的方法具有重要意义。为建立有效的免疫学检测方法，我们做了以下工作：
　　 TK(ORF55)和ORF72基因的克隆根据NCBI公布的序列（GenBank登录号：DQ177346.1）的设计出特异性引物扩增TK(ORF55)和ORF72基因。扩增出片段大小为1113bp和672bp。分别克隆到原核表达载体pGEX-4T1和pET28a上转化大肠杆菌DH5α，构建重组质粒pGEX-4T1-TK和pET28a-ORF72。经PCR，酶切，测序鉴定后，获得阳性重组质粒。pET28a-ORF72表达蛋白的诱导表达纯化与抗KHVpET28a-ORF72蛋白多克隆抗体的制备将质粒转化E.coli BL21(DE3)，用IPTG诱导获得高效表达，经SDS-PAGE分析，表达的重组蛋白的分子量分别为48kDa与41kDa，分别命名为pGEX-4T1-TK与pET28a-ORF72。表达产物主要以包涵体形式存在，Western blot证实表达产物具有良好的反应原性。利用MERCK公司的His-Tag融合蛋白纯化柱Ni+-NTA His Bind纯化pET28a-ORF72表达蛋白，经测定蛋白含量为0.4mg/mL。第一次免疫用弗氏全佐剂和纯化蛋白按1:1比例，皮下多点注射。2周后，用弗氏不完全佐剂和纯化蛋白按1:1比例进行第二次免疫，皮下多点注射。2周后进行第三次免疫。一星期后兔耳静脉采血，分离血清，获得多克隆抗体。
　　 兔多克隆抗体的鉴定分别包被病毒悬液、表达蛋白、PBS，稀释多抗，测定多抗效价为9000。SDS-PAGE表达全蛋白和纯化蛋白，转到NC膜上，一抗选用所制备的兔多抗(1:5000)，二抗选用HRP标记的羊抗兔血清(1:10000)，western-bolt实验在表达蛋白和纯化蛋白处有明显特异性条带出现，表明制备出的多抗具有免疫原性。比例稀释表达蛋白，以表达蛋白，KHV病毒悬液做抗原，SVC病毒悬液做对照，经免疫酶斑点试验发现产生反应。实验获得的多抗血清为KHV的免疫学检测方法的建立奠定了基础。