南美响尾蛇神经毒素(Crotoxin)诱导NCI-H661细胞凋亡机制研究

摘要

目的：观察南美响尾蛇神经毒素(crotoxin，CrTX)对人大细胞肺癌细胞体外培养抗肿瘤作用，以及对人大细胞肺癌细胞裸鼠移植瘤抗肿瘤作用，并探讨其相关作用机制。
　　方法：通过四唑盐还原法(CCK-8)检测南美响尾蛇神经毒素(crotoxin)、吉非替尼(Gefinitib)及两药联合应用对人大细胞肺癌NCI-H661细胞的生长抑制率，应用细胞集落平板克隆实验观察crotoxin、gefinitib及两药联合应用对NCI-H661细胞的集落形成的影响；应用流式细胞术检测crotoxin、gefinitib及两药联合应用对NCI-H661细胞周期及细胞凋亡率的影响，并检测以SB203580抑制p38活性，以PFT-α抑制wtp53的活性后NCI-H661细胞周期及细胞凋亡率的变化；应用蛋白免疫印迹法(Western blot)测定 crotoxin、gefinitib及两药联用对 NCI-H661细胞内 p38MAPK、wtp53、phospho-p38MAPK、bax、bcl-2及 caspase-3活性亚单位 p17蛋白表达水平影响，并测定以SB203580抑制p38活性，以PFT-α抑制wtp53的活性后crotoxin、gefinitib及两药联合应用对 NCI-H661细胞内以上6种蛋白表达水平变化。将人大细胞肺癌NCI-H661细胞接种裸鼠腋下建立荷瘤裸鼠模型。将荷瘤裸鼠随机分为6组，crotoxin组、gefinitib组、crotoxin+gefiniti组、crotoxin+SB203580组、crotoxin+PFT-α组和阴性对照组。实验组裸鼠腹腔注射给药，每三天给药一次，同时阴性对照组注射等量生理盐水。给药4周后完整取出皮下移植瘤结节，对比较不同干预组和对照组移植瘤瘤重，计算抑瘤率。
　　结果：Crotoxin对NCI-H661细胞有生长抑制作用，与gefinitib联用可增强gefinitib抗肿瘤效果,与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；Crotoxin对NCI-H661细胞集落形成有抑制作用，与gefinitib联用可增强gefinitib对NCI-H661细胞集落形成抑制效果，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；Crotoxin对人大细胞肺癌 NCI-H661细胞有诱导凋亡和细胞周期G1期阻滞作用，且crotoxin与gefinitib联用可增强 gefinitib对 NCI-H661细胞诱导凋亡和细胞周期 G1期阻滞作用，以SB203580抑制p38活性，以PFT-α抑制wtp53的活性后，crotoxin诱导凋亡和细胞周期G1期阻滞作用可被抑制。Western blot实验中crotoxin、 gefinitib、crotoxin+gefinitib组中 phospho-P38MAPK、wtP53、caspase3活性亚单位 P17、bax蛋白表达水平与对照组相比表达增高，且crotoxin、 gefinitib组表达量接近，Crotoxin+Gefinitib组高于前两者； bcl-2蛋白表达水平较对照组下调，且crotoxin+gefinitib组低于crotoxin、gefinitib组，差异有统计学意义。crotoxin+SB203580组中phospho-P38MAPK、wtP53、caspase3活性亚单位 P17、bax、bcl-2蛋白表达水平与对照组相接近，差异无统计学意义。 Crotoxin+PFT-α组中phospho-P38MAPK、wtP53蛋白表达水平比对照组高，差异有统计学意义；caspase3活性亚单位 P17、bax、bcl-2蛋白表达水平与对照组无明显变化，差异无统计学意义。各组中 p38MAPK蛋白表达水平接近对照组，无统计学差异。Crotoxin，gefinitib均对人大细胞肺癌NCI-H661细胞移植瘤生长有抑制作用，二者联合应用可显著提高抑瘤作用,其抑瘤率分别是39.5％、43.7%及75.1%，与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：Crotoxin对人大细胞肺癌NCI-H661细胞体外生长有抑制作用，与gefinitib联用可增强gefinitib抗肿瘤效果，其作用与诱导凋亡和G1期阻滞有关，其中诱导凋亡作用可能和激活 P38MAPK信号转导通路进而活化 caspase3有关，G1期阻滞可能由胞内 wtP53蛋白表达上调所致。Crotoxin对人大细胞肺癌 NCI-H661细胞移植瘤生长有抑制作用,且crotoxin可增强gefinitib对人大细胞肺癌NCI-H661细胞裸鼠移植瘤抑制作用。

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引言

1. 材料与方法

2. 结 果

3. 讨 论

参考文献

综述:p38及其下游基因与在细胞凋亡中的作用

攻读学位期间公开发表的论文

致谢