DNA异常甲基化在氡与香烟烟雾致BEAS-2B细胞恶性转化过程中的作用

摘要

目的：
　　通过体外单独染氡、香烟及联合染毒诱导BEAS-2B细胞发生恶性转化，建立恶性转化细胞模型。通过检测细胞恶性转化过程中甲基化转移酶基因 mRNA表达以及全基因组甲基化水平的改变，以及利用高通量甲基化芯片筛选单独及联合染毒发生DNA启动子区域异常甲基化的特异基因，探索氡、香烟联合致肺癌的机制，为氡、香烟联合致肺癌的防治提供理论依据。
　　方法：
　　将处于对数生长期的BEAS-2B细胞以1.5×105个接种于0.4μm Transwell膜中，细胞贴壁后将Transwell膜置于染毒腔内，毒气持续泵入在膜上方直接与细胞接触染毒，氧气浓度恒定于21％，水浴维持染毒腔温度在37℃，每次同时染毒3个。实验设对照组 C、氡气染毒组 Rn、香烟烟雾染毒组 Sm和联合染毒组 RS。使用 CCK-8试剂盒检测不同氡、香烟染毒浓度后细胞存活率，确定合适的单独及联合染毒剂量。染氡两次后将Transwell膜中细胞消化，置于培养瓶中常规培养，待生长至对数生长期后进行下一代染氡，共染毒15代。对照组暴露于浓度为空气本底值的相同装置中，其余条件同染毒组。完成15代染毒并传代至20代后，流式细胞仪分析细胞周期、凋亡变化，软琼脂分析克隆形成，酶标仪检测全基因组甲基化水平，荧光定量 PCR检测DNMT1、DNMT3A和DNMT3B基因mRNA表达情况。Illumina450k甲基化芯片筛选单独及联合染毒发生异常甲基化的特异基因，并检测 SPDEF、CDK5RAP1、PTPRM和ABCG1基因mRNA表达情况。
　　结果：
　　（1）细胞恶性转化模型的建立。在染毒时间相同条件下，随染毒剂量升高，细胞存活率逐渐下降；氡、烟联合染毒CI值＜1，提示二者具有协同效应；确定氡染毒浓度和时间为20000Bq/m3，30min；香烟烟雾染毒浓度和时间分别为20%，10min。细胞周期显示染毒15代传代20代的细胞G1期明显缩短，S期明显延长，联合染毒组细胞S期延长最为明显，表明细胞处于增殖旺盛状态，其周期发生一定程度的失控，同时细胞凋亡率明显降低，呈现凋亡抑制状态。与对照组相比，染毒15代传代20代细胞软琼脂克隆形成能力已明显形成，联合染毒组细胞软琼脂克隆形成率已达到24.00±0.31（P<0.05）。（2）全基因组甲基化水平及甲基化水平的改变：与对照组相比，单独及联合染毒组全基因组甲基化水平呈下降趋势，染毒15代传代20代细胞甲基化水平降至最低；染毒组细胞DNMT1基因表达明显降低，DNMT3A,DNMT3B基因表达明显升高，表明染毒后BEAS-2B细胞在发生了全基因组低甲基化的同时伴有部分CPG岛的高甲基化。（3）甲基化芯片筛选氡、烟单独及联合染毒特异性基因：利用Illumina450k甲基化芯片对Rn15-20,Rs15-20,Sm15-20进行检测，筛选出SPDEF，CDK5RAP1，PTPRM，ABCG1基因。联合染毒组异常甲基化基因 CDK5RAP1，在细胞的周期与凋亡调控中占据重要地位；单独染氡组异常甲基化基因ABCG1，负责调控细胞内胆固醇的动态平衡；单独染烟组异常甲基化基因PTPRM，参与内皮细胞增殖负调节，内皮细胞迁移的负调控；氡、烟单独染毒组交集基因 SPDEF,介导细胞增殖、分化和恶性变。对筛选基因 mRNA表达情况进行进一步检测与分析，发现与对照组相比，联合染毒组 CDK5RAP1 mRNA表达降低明显；单独染毒组SPDEF mRNA表达升高明显；氡染毒组 ABCG1 mRNA表达升高明显；烟染毒组PTPRM mRNA表达降低明显（P<0.05)。
　　结论：
　　1.建立了体外染氡、烟联合染毒诱发 BEAS-2B细胞恶性转化模型，且氡、烟具有协同效应。2.恶性转化过程中，DNA甲基化转移酶mRNA表达发生改变，且全基因组甲基化水平降低。3.氡、烟单独及联合染毒发生异常甲基化的基因可能是单独及联合染毒致BEAS-2B细胞恶性转化的不同作用机制。

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引言

第一部分 氡与香烟烟雾联合染毒染毒诱发BEAS-2B细胞恶性转化模型的建立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二部分 氡及香烟烟雾联合染毒诱发BEAS-2B细胞全基因组甲基化水平变化及甲基化转移酶表达改变的研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三部分 DNA甲基化芯片筛选氡及香烟烟雾联合染毒诱发BEAS-2B细胞恶性转化异同基因及其表达研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

结论

参考文献

综述: DNA甲基化转移酶在肺癌发生中的作用

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