肾癌细胞中内源性Wnt以自分泌的方式刺激Fzd7的胞吞作用

摘要

Wnt蛋白作为分泌型糖蛋白可以结合Fzd受体家族的胞外N-末端半胱氨酸富含区域。在Wnt协同受体存在的条件下，Fzd受体可以应答Wnt蛋白，从而激活经典及非经典信号通路。研究发现，在多种肿瘤中Wnt和Fzd的过表达或者是组成性激活突变基因Fzd的表达与Wnt/β-catenin通路的激活相关。Wnt信号通路参与肾细胞癌（RCC）的形成与发展。Fzd7分子是Fzd受体家族的一员，参与调控细胞的增殖、分化、迁移、组织的极性以及肿瘤的发生、发展等，但对Fzd7在肾透明细胞癌（ccRCC）中的表达研究目前并没有相关报道。此外，现有研究结果表明，在多种肿瘤细胞中，Wnt可以以自分泌机制激活经典以及非经典信号通路，并且Wnt可通过结合膜表面Fzd受体来传导信号通路并被内化。一些研究者发现内化的Wnt-受体复合体可增强Wnt信号通路。另有研究显示，在经典和非经典信号通路中，Wnt配体都可以诱导相应的Fzd受体发生胞吞，且Fzd胞吞或胞内运输所引起的变化对信号通路有一定的影响，这一作用似乎成为经典及非经典信号通路的必要组成成分。但是，对于肾细胞癌中，Wnt信号对Fzd受体的作用及相应机制目前尚未有相关研究。
　　本研究旨在检测ccRCC组织及RCC细胞中Fzd7的表达水平，并以肾癌细胞为研究对象，通过控制Wnt信号的活性，探讨其对Fzd7表达调节的相关机制。
　　本论文主要包括以下两部分内容：
　　一、ccRCC组织、癌旁组织及肾癌细胞中Fzd7的表达水平的检测
　　【目的】检测ccRCC组织、癌旁组织及肾癌细胞中Fzd7的表达水平。
　　【方法】免疫组化检测53例 ccRCC组织及相应的癌旁组织中 Fzd7的表达，western blot检测三株RCC细胞系786-O、OS-RC-2、Caki-1细胞中Fzd7的表达，并通过内切糖苷酶H和N-糖苷酶F进行去糖基化实验，检测RCC细胞中是否存在糖基化修饰现象。
　　【结果】免疫组化结果显示，约36％的ccRCC组织存在Fzd7的表达，与癌旁组织相比，Fzd7在癌组织中过表达，说明Fzd7在肿瘤发展过程中发挥作用；western blot结果显示，三株RCC细胞中，Fzd7存在多条主条带，包括Fzd7单体64kD，以及60 kD，35kD两条条带，内切糖苷酶H和N-糖苷酶 F处理对Fzd7在三种RCC细胞中的条带分布无显著影响，说明这三条条带并非Fzd7未成熟的糖基化形式，那么分子量小于64kD的条带很有可能是未完成合成的Fzd7或者是Fzd7胞吞后被降解的条带。
　　【结论】确定了ccRCC组织及RCC细胞中存在Fzd7的表达，为进一步研究RCC细胞中Wnt诱导Fzd7的胞吞作用提供了研究基础。
　　二、内源性Wnt诱导Fzd7的胞吞作用的研究
　　【目的】研究RCC细胞中内源性Wnt信号分子诱导Fzd7受体的胞吞作用。
　　【方法】体外培养RCC细胞系786-O、OS-RC-2、Caki-1细胞，采用RT-PCR和Real-time PCR检测几种经典Wnts的表达；用Wnt分泌抑制剂IWP-2、Clathrin抑制剂氯丙嗪和caveolae抑制剂制霉菌素处理细胞后，western blot检测Fzd7蛋白的变化，以及IWP-2处理后细胞总蛋白中β-catenin和磷酸化β-catenin、细胞浆中β-catenin以及细胞核中β-catenin的变化；Real-time PCR检测RCC细胞中Fzd7的表达水平，通过Fzd7shRNA、GFPshRNA转染786-O细胞，并通过Wnt3a处理Fzd7shRNA/786-O和GFPshRNA/786-O细胞，MTS分别检测细胞的增殖率。
　　【结果】Western blot结果显示，Wnt分泌抑制剂IWP-2作用于RCC细胞后，可显著增加 Fzd7单体64kD条带；Clathrin抑制剂氯丙嗪作用786-O细胞后，Fzd7单体以剂量依赖性的方式增加，而caveolae抑制剂制霉菌素则对Fzd7表达无明显影响，说明内源性Wnt主要通过clathrin介导刺激Fzd7的胞吞作用。不同浓度的IWP-2处理RCC细胞，10uM IWP-2处理后，可显著增加磷酸化β-catenin水平，并降低总β-catenin水平，此外，IWP-2可抑制OS-RC-2细胞中β-catenin的核转移，说明IWP-2可一定程度上抑制经典通路的激活，且可推断RCC细胞中内源性Wnt激活经典通路。Real-time PCR结果显示，786-O细胞中Fzd7 mRNA水平显著高于OS-RC-2以及Caki-1细胞；细胞增殖实验显示，与GFPshRNA质粒转染相比，Fzd7 shRNA转染可显著降低786-O细胞的生长速度；Wnt3a处理Fzd7shRNA/786-O细胞和GFPshRNA/786-O细胞，可诱导细胞增殖，且Fzd7shRNA/786-O细胞增殖速度高于GFPshRNA/786-O细胞，说明Fzd7在肾细胞癌细胞的增殖过程中发挥作用。
　　【结论】RCC细胞中，内源性Wnt激活经典信号通路，诱导Fzd7的胞吞作用，并且这一作用由Clathrin途径参与介导，此外，Fzd7在肾细胞癌细胞的增殖过程中发挥作用。

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引言

第一部分 ccRCC组织、癌旁组织及肾细胞癌细胞中Fzd7的表达水平的检测

1 材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第二部分 内源性Wnt对Fzd7胞吞作用的调节机制研究

1 材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

论文总结

参考文献

综述:Fzd7作为肿瘤潜在治疗靶点的研究

攻读学位期间公开发表的论文

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致谢