钟基因Period1和Period2对神经炎症调控机制的研究

摘要

目的：观察钟基因Period1（Per1）和Period2（Per2）在LPS作用下对神经炎症的调控作用，并进一步研究其作用机制。
　　方法：采用小鼠小胶质瘤细胞系BV2细胞，分别对钟基因Per1和Per2进行基因敲减后，使用脂多糖（LPS）100 ng/ml预处理12 h，用ELISA方法检测细胞培养基中的炎症相关因子TNF-α和IL-6的释放量，使用NO试剂盒检测了NO的含量；用免疫印迹方法检测细胞中炎症相关蛋白iNOS和COX2的表达。使用Per1和Per2基因敲除鼠，分别在侧脑室注射2μg LPS，建立在体神经炎症模型，6 h后取鼠脑，提取RNA。使用实时荧光定量PCR（q-PCR）的方法检测炎症的相关因子IL-6，TNF-α、iNOS和COX2的mRNA水平。侧脑室注射2μg LPS7天后取鼠脑，进行抗GFAP的免疫荧光法染色，检测Per1和Per2基因敲除对鼠脑星形胶质细胞激活的影响。为了进一步证实Per1和Per2对神经炎症的作用，取新生Per1和Per2基因敲除鼠原代星形胶质细胞进行培养，培养成功后予以LPS100 ng/ml刺激24 h，取细胞培养基用ELISA方法检测炎症相关因子TNF-α和IL-6的释放；同时用免疫印迹方法检测细胞中炎症相关蛋白iNOS和COX2的表达。为了探讨钟基因 Per1和Per2对神经炎症产生影响的作用机制，使用了Per1、Per2基因敲除鼠的原代星形胶质细胞给予LPS100 ng/ml刺激后用免疫印迹方法检测NF-κB通路中p65和IκBα的表达，并且使用免疫荧光技术检测了p65核转位情况；使用核质分离技术检测Per2基因敲减的BV2细胞在LPS刺激后细胞质和细胞核内p65的蛋白含量。
　　结果：与对照组相比，Per1基因敲减的BV2细胞在LPS刺激12 h后，细胞培养基中释放 TNF-α和 IL-6的量明显减少，NO的含量明显降低；细胞中激活 iNOS和COX2的表达也显著减少。Per2基因敲减的BV2细胞在LPS刺激下细胞培养基中释放的TNF-α和IL-6显著升高，NO的含量明显上升。细胞中激活的iNOS和COX2的表达明显增加。与野生型鼠相比较，LPS作用下Per1基因敲除鼠脑中IL-6、TNF-α、iNOS和COX2的mRNA水平显著降低；Per2基因敲除鼠脑中IL-6、TNF-α、iNOS和COX2的mRNA水平显著升高。抗GFAP免疫荧光结果显示，Per1基因敲除能够抑制LPS诱导鼠脑星形胶质细胞的激活，在局部皮层和纹状体区域抑制作用较明显；而Per2基因敲除能够显著增加LPS诱导鼠脑星形胶质细胞激活的反应，在局部皮层与纹状体区域增强星形胶质细胞激活反应尤其明显。在原代星形胶质细胞模型中，与野生型鼠的原代星形胶质细胞相比较，在给予了LPS刺激后Per1基因敲除鼠的原代星形胶质细胞培养基中TNF-α和IL-6的含量显著降低，同时细胞中iNOS和COX2的表达也下降。而在Per2基因敲除鼠的原代星形胶质细胞中，释放到细胞培养基中的TNF-α，IL-6的含量显著提高，同时细胞中iNOS和COX2的表达也明显增加。在对机制的研究中发现，与野生型鼠相比较，Per1基因敲除鼠原代星形胶质细胞在LPS的诱导下，随着时间的延长，p65的表达量减少。Per2基因敲除鼠原代星形胶质细胞中加入LPS后p65的表达不变，但是IκBα的蛋白量在给予LPS后显著减少；同时在LPS刺激30 min后，免疫细胞学实验发现原代星形胶质细胞中的核内的p65相比较野生型鼠明显增加，同时BV2细胞的核质分离实验发现，Per2基因敲减的细胞核中p65的量显著增加，而细胞质中p65的量则显著减少。
　　结论：钟基因Per1的缺失可以显著抑制LPS诱导的神经炎症反应，其作用机制可能与细胞中p65的含量减少相关。钟基因Per2的缺失可以显著增加LPS诱导的神经炎症反应，其作用机制是在LPS刺激下，钟基因Per2缺失能促使NF-κB通路中IκΒα的降解，从而促进了p65向细胞核内转运，最终使炎症因子转录释放增多，促进了LPS诱导的炎症反应的发生。

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英文摘要

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第一章 前言

一、研究背景

二、课题的研究内容

三、课题的创新点

第二章 材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

第三章 结果与讨论

一、钟基因 Per1或Per2敲减的小胶质细胞在LPS刺激下呈现出不同的炎症反应

二、LPS作用下Per1和Per2 基因敲除小鼠的神经炎症反应

三、LPS作用下Per1和Per2 基因敲除鼠原代星形胶质细胞的炎症反应

四、LPS的刺激下钟基因 Per1和Per2对NF-κB信号通路的不同作用

五、讨论

六、结论

参考文献

综述: 生物钟基因Period、昼夜节律和癌症

英文缩写词表

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