MiR-145通过靶向作用于Smad3抑制鼻咽癌的侵袭和转移能力

摘要

目的：鼻咽癌是头颈外科肿瘤中常见的癌症，具有高度的转移能力，在亚洲地区较为流行，特别是在中国南方。随着表观遗传学的不断发展，近年来 miRNA在多种肿瘤中的各种生物学作用越来越受到科研工作者的重视。miR-145被报道在多种肿瘤中发挥抑制肿瘤的作用，并且已有报道miR-145在鼻咽癌组织中明显低表达，但其功能仍未有报道。
　　本研究旨在验证miR-145在鼻咽癌组织标本及鼻咽癌细胞中的表达情况，通过探讨鼻咽癌中miR-145的生物学功能及其可能的调控机制，为鼻咽癌的诊断和治疗提供确凿的实验依据和新的方向。
　　方法：（1）采用Real-Time PCR和Western Blot方法分别检测在人永生化的鼻咽部上皮细胞NP69和3株鼻咽癌细胞（CNE-1、CNE-2和CNE-2Z）以及11对鼻咽癌组织样本中miR-145的表达水平。（2）将miR-145的模拟体miR-145 mimics（miR-NC）和抑制剂miR-145 inhibitor（miR-NC inhibitor）转染至高转移的鼻咽癌细胞株（CNE-2和CNE-2Z）中，通过CCK-8实验观察细胞的增殖情况，以及Transwell实验了解其对细胞迁移、侵袭的影响。（3）生物信息学软件 TargetScan、PicTar和 miRanda对miR-145的靶基因进行预测，初步筛选出目的基因Smad3。运用双荧光素酶活性检测实验验证相关 miR-145是否与 Smad33’UTR区域的种子序列直接靶向结合，验证靶基因。在鼻咽癌细胞株中过表达和抑制表达miR-145后检测 Smad3 mRNA和蛋白表达水平。（4）将si-Smad3（si-NC）转染至鼻咽癌细胞中，使用Western Blot技术检测Smad3的蛋白表达情况，以确保干扰Smad3的效果，通过CCK-8方法观察细胞的增殖情况，及应用Transwell试验了解其对细胞迁移、侵袭的影响。（5）qRT-PCR方法检测在人永生化的鼻咽部上皮细胞NP69和3株鼻咽癌细胞以及11对鼻咽癌组织样本中Smad3的表达情况，并将其和miR-145的表达作回归分析，统计出鼻咽癌中miR-145和Smad3表达的相关性。
　　结果：
　　（1）与NP69相比，miR-145在鼻咽癌细胞株CNE-1、CNE-2和CNE-2Z的表达均是明显下调的；同样，与11例鼻咽部非肿瘤组织相比，11例鼻咽癌组织样本中miR-145表达下调。综上所述，miR-145在鼻咽癌中低表达。
　　（2）在转染miR-145 mimics后CNE-2和CNE-2Z细胞株细胞增殖明显减慢，细胞的迁移及侵袭能力显著下降。而在转染miR-145 inhibitor后，呈现出相反的结果。
　　（3）生物信息学软件预测分析出可能与miR-145特异结合的靶基因的3’UTR区，通过瞬时转染miR-145 mimics（miR-NC）和miR-145 inhibitor（miR-NC inhibitor）检测靶基因在mRNA和蛋白水平的表达改变情况以及双荧光素酶报告基因实验验证，最后得出Smad3作为miR-145的目的基因成为本次研究的靶基因。
　　（4）将si-Smad3转染到CNE-2和CNE-2Z细胞株后，我们发现Smad3的蛋白表达水平明显下降，表明si-Smad3成功地干扰了Smad3的表达，生物学功能实验结果显示转染 si-Smad3后细胞增殖未见明显变化，细胞的迁移及侵袭能力下降。表明鼻咽癌中Smad3可能主要发挥促进鼻咽癌转移的作用。
　　(5)与NP69相比，在鼻咽癌细胞株CNE-1、CNE-2和CNE-2Z中Smad3的表达明显上调；在11例鼻咽癌组织样本中检测得到Smad3的表达与11例鼻咽部非肿瘤组织相比也是上调的。也就是说，在鼻咽癌中Smad3是高表达的。将其和miR-145的表达作回归分析发现鼻咽癌中两者的表达之间是呈负相关。
　　结论：
　　本实验表明miR-145在人鼻咽癌中呈现低表达水平，通过发挥抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭能力，进而发挥抑制肿瘤的作用。利用生物信息学和双荧光实验等方法发现并验证miR-145的直接靶基因Smad3。干扰Smad3后鼻咽癌的迁移和侵袭能力明显受到了抑制，与miR-145作用结果相一致；Smad3在鼻咽癌组织和细胞中高表达，与miR-145之间呈现负相关，进一步证实了miR-145可以通过特异性结合Smad3的3’UTR区发挥抑制鼻咽癌侵袭和转移的作用。为进一步深入研究鼻咽癌的发病机制及诊断治疗鼻咽癌提供了科学的理论基础。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

前言

参考文献

第一部分 miR-145在鼻咽癌中的表达及对细胞增殖、迁移和侵袭的影响

引言

材料与方法

结果

第二部分 miR-145靶基因的预测及验证，靶基因功能的研究及两者之间的关系

引言

材料与方法

结果

全文总结

全文讨论

参考文献

综述: 头颈肿瘤中miRNA研究进展

缩略词表

攻读硕士学位发表的论文

致谢