IL-6/JAK/STAT3信号通路介导EGFR活化调控PD-L1表达并影响细胞增殖作用机制研究

摘要

【目的和背景】PD-1/PD-L1途径介导的负性调控信号能有效抑制机体T、B细胞功能，在机体免疫应答后期的负性调节中发挥了至关重要的作用。近来有报道称PD-L1的表达与EGFR的突变状态相关，但调控机制仍不明确。IL-6/JAK/STAT3为EGFR下游的一个重要信号传导途径，在促进肿瘤细胞增殖过程中起到重要作用，同时有报道转录因子STAT3可直接结合到PD-L1的启动子区，从而促进PD-L1的转录。本文旨在探究IL-6/JAK/STAT3信号通路作为EGFR下游途径是否与其调控PD-L1表达相关，并通过影响PD-L1的表达最终发挥影响细胞增殖的功能。
　　【方法】（1）对肺腺癌细胞株 HCC827、PC-9、H1975进行基因测序，明确其EGFR突变位点，并用CCK-8法检测细胞株对吉非替尼的IC50。（2）用RT-PCR及Western blot分别在mRNA及蛋白水平上检测EGFR野生型细胞株（H1299，SPC-A1，A549）和EGFR突变型细胞株（HCC827，PC-9，H1975）中PD-L1的表达。（3）选取HCC827和PC-9为研究对象，使用不同浓度 EGF加以刺激，并用 RT-PCR检测PD-L1的表达，选取最佳刺激浓度，用Western blot检测p-EGFR、PD-L1、p-STAT3及STAT3的表达。（4）用不同浓度的吉非替尼刺激细胞株，Western blot检测PD-L1、p-STAT3及STAT3的表达；（5）分别用含吉非替尼和含DMSO的培养基刺激HCC827及PC-9细胞株，收集不同时间段的细胞上清，用Elisa试剂盒检测IL-6的表达。（6）分别采用外源加入AG490及STAT3 siRNA干扰实验来阻断JAK/STAT3信号通路，用RT-PCR检测PD-L1的表达，Western blot检测PD-L1、p-STAT3及STAT3的表达。（7）应用siRNA干扰技术成功沉默PD-L1的表达后，采用CCK-8法及克隆形成实验检测细胞增殖、并流式细胞术检测细胞凋亡。
　　【结果】（1）HCC827及PC-9为19号外显子缺失且对吉非替尼敏感的肺腺癌细胞株，而H1975为20号外显子T790M突变合并21号外显子L858R突变且对吉非替尼耐药的肺腺癌细胞株。（2）EGFR突变型胞株PD-L1的表达高于EGFR野生型细胞株。（3）用EGF刺激HCC827及PC-9细胞活化EGFR信号通路后，PD-L1表达上调，且伴随p-STAT3上调，STAT3无明显变化。（4）用吉非替尼刺激HCC827及PC-9细胞抑制EGFR信号通路后，PD-L1表达下调，p-STAT3表达下降，STAT3无明显变化。（5）在分别用含吉非替尼和含DMSO的培养基刺激HCC827及PC-9细胞株后，我们发现吉非替尼组的细胞上清 IL-6含量虽然随着刺激时间的延长有所增加但是其总体上升趋势较DMSO组慢。（6）AG490抑制JAK/STAT3信号通路后下调了PD-L1的表达，而用STAT3 siRNA沉默STAT3表达后可达到同样的效果。（7）用PD-L1 siRNA沉默PD-L1表达后细胞增殖能力降低，凋亡增加。
　　【小结】EGFR-TKI可以通过下调IL-6的分泌来阻断JAK/STAT3信号通路，进而调控STAT3表达，最终抑制PD-L1的表达，并通过PD-L1的表达变化影响细胞增殖功能。因此，EGFR-TKI不仅可以直接抑制肿瘤生长还可以通过抑制IL-6/JAK/STAT3信号通路下调PD-L1的表达来调节肿瘤免疫微环境，为肺癌的靶向治疗和免疫治疗相结合提供了实验依据和理论基础，其临床意义还有待进一步探究。

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一．前言

参考文献

IL-6/JAK/STAT3信号通路介导EGFR活化调控PD-L1表达并影响细胞增殖作用机制研究

二、材料和方法

（一）材料

（二）实验方法

三．实验结果

3.1 PD-L1表达与EGFR基因突变状态密切相关

3.2活化或抑制EGFR信号通路可影响PD-L1表达

3.3 EGFR途径调控PD-L1表达需要IL-6/JAK/STAT3信号通路参与

3.4 PD-L1可以通过抑制肿瘤细胞凋亡而促进其增殖

四．结论

五．讨论

参考文献

展望

综述

附录：缩略词表及注释

攻读学位期间公开发表论文

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