CDX2调控miRNA-32表达影响胃癌细胞增殖、迁移和侵袭作用及机制的初步研究

摘要

背景和目的：
　　胃癌是我国高发的恶性肿瘤之一，胃癌的转移是导致病人预后不良和生存率差的主要因素，越来越多的证据表明，胃癌细胞侵袭转移与上皮-间质转化（EMT）密切相关。尾型同源盒转录因子2（CDX2）在决定胃上皮干细胞的分化进程中发挥至关重要的角色，CDX2表达阳性的胃癌术后生存率明显高于CDX2表达阴性患者，提示CDX2是胃上皮细胞分化和抑制胃癌发生的关键转录因子。我们预实验发现胃癌细胞上调CDX2表达后，应用miRNA芯片检测差异表达的miRNA，结果显示，miRNA-32上调倍数较高。有文献报道，miRNA-32在肺癌和口腔癌中起着抗癌基因的作用。我们的研究也发现上调miRNA-32表达可明显抑制人胃癌细胞SGC-7901的生长及侵袭能力。然而，CDX2是否直接调控miRNA-32表达而抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力？这一作用是否与胃癌细胞EMT有关？目前鲜有文献报道。本研究首先在胃癌患者术后组织标本中探讨CDX2和miRNA-32的表达与病人临床病理特征及其与胃癌患者预后的关系。随后，通过过表达或干扰表达CDX2后检测胃癌细胞中CDX2与miRNA-32表达的时-效关系，探讨CDX2调控miRNA-32表达后对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭等恶性行为及EMT表型的影响。最后，在裸鼠皮下胃癌移植瘤模型中进一步验证CDX2调控miRNA-32表达对人胃癌裸鼠皮下移植瘤的影响及其对EMT的作用。
　　方法：
　　1.免疫组织化学技术检测60例胃癌患者术后石蜡切片标本中 CDX2蛋白的表达，分析其与临床病理特征的关系，随访患者生存资料，分析CDX2表达对患者术后复发和生存期等预后的影响；应用实时荧光定量（RT）-PCR检测50例胃癌患者术后新鲜冰冻组织中CDX2 mRNA和miRNA-32表达，分析两者与胃癌临床病理特征之间的关系，同时分析CDX2和miRNA-32之间的相关性，探讨其临床意义。
　　2. RT-PCR和Western blot检测三株胃癌细胞中CDX2的内源性表达。设计空质粒组（对照组）、过表达 CDX2组（PEGFP-N1-CDX2真核表达质粒转染 MKN-45细胞）、过表达CDX2和干扰miR-32组（CDX2真核表达质粒和miR-32 inhibitor共同转染MKN-45细胞）；干扰CDX2组（CDX2-shRNA质粒转染AGS细胞）和干扰表达CDX2和上调miRNA-32组（CDX2shRNA和miR-32 mimic共同转染AGS细胞）为研究对象。应用脂质体法分别将高表达CDX2质粒、miR-32 inhibitor质粒、干扰表达CDX2质粒、miR-32 mimic质粒和空质粒转染相应胃癌细胞株，应用RT-PCR法检测各组细胞在不同时间点CDX2 mRNA及miRNA-32的动态表达变化，染色质免疫沉淀（ChIP）检测CDX2与miRNA-32基因启动子的相互作用位点；应用CCK-8法、克隆形成实验检测各组细胞增殖能力，划痕试验检测各组细胞迁移能力，Transwell小室侵袭实验检测各组细胞侵袭能力。Western blot法检测各组细胞上皮-间质标志物E-cadherin和Vimentin蛋白水平变化。
　　3.设计空质粒对照组（空质粒转染 MKN-45细胞）、过表达 CDX2组（PEGFP-N1-CDX2真核表达质粒转染 MKN-45细胞）、干扰表达 CDX2组（CDX2-shRNA质粒转染MKN-45细胞）、过表达CDX2和干扰miRNA-32组（CDX2真核表达质粒和miR-32 inhibitor共同转染MKN-45细胞）为研究对象，建立人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型。观察并比较裸鼠的一般情况、肿瘤的生长情况，描绘生长曲线，计算抑瘤率，HE染色观察肿瘤细胞的形态变化，免疫组织化学法检测移植瘤组织中CDX2蛋白的表达，RT-PCR检测移植瘤组织CDX2 mRNA、miRNA-32表达水平，Western blot检测移植瘤组织中CDX2、E-cadherin和Vimentin蛋白水平变化。
　　结果：
　　1.免疫组化染色结果提示，在胃癌细胞中 CDX2阳性信号主要位于细胞核中，在胃癌组织中CDX2蛋白总体阳性表达率为35/60(58.3％)，其中Ⅰ～Ⅱ期和无淋巴结转移的患者CDX2阳性表达水平较Ⅲ～Ⅳ期和淋巴结转移的患者阳性率高（P<0.05）。CDX2阳性患者术后1～5年的累计复发率分别为20.0%、45.7%、71.4%、82.8%和91.4%，而CDX2阴性者手术后1～5年的累计肿瘤复发率分别为40.0%、80.0%、96.0%、100.0%和100.0%，且CDX2阴性患者术后中位复发时间明显短于CDX2阳性患者，两组手术后2～4年的累计肿瘤复发率、1～5年中位复发时间和总体生存期比较均有显著性差异（均P<0.05）。RT-PCR检测结果提示，CDX2 mRNA和miRNA-32表达与胃癌浸润深度、胃癌 TMN分期、淋巴转移有关（P<0.05），与肿瘤的分化程度、性别、年龄、肿瘤大小无关（P>0.05）。相关性分析提示，胃癌组织中CDX2 mRNA和miRNA-32表达呈显著正相关（r=0.861，P<0.05）。
　　2.胃癌细胞中CDX2内源性表达水平依次为AGS>MKN-45>SGC-7901。过表达或干扰CDX2表达后，在0、24、48、72h时间点，miR-32的表达随CDX2表达的升高而升高，降低而降低（均P<0.05）；ChIP检测提示，MNK-45和AGS细胞中CDX2抗体能够特异性结合部分 miRNA-32基因启动子的引物对应区。上调 CDX2诱导miRNA-32表达后，能够抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力（P<0.05），然而过表达CDX2后应用miR-32 inhibitor下调miRNA-32表达，这种抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭作用减弱，与对照组比较无统计学意义（P>0.05）；干扰 CDX2表达抑制miRNA-32表达后，具有促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力（P<0.05），同样干扰CDX2后应用miR-32 mimic上调miRNA-32表达，促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭作用也出现减弱，与对照组比较无统计学意义（P>0.05）。随后，Western blot检测发现，CDX2表达上调时E-cadherin蛋白表达升高、Vimentin蛋白表达减少，而CDX2表达下调时 E-cadherin蛋白表达下降、Vimentin蛋白表达增高，但分别应用 miR-32 inhibitor和miR-32 mimic进行干预后，E-cadherin和Vimentin蛋白动态变化又出现逆转。
　　3.选择CDX2中等表达水平的MKN-45细胞株，成功建立了人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型。过表达CDX2组成瘤率为80%，干扰CDX2组成瘤率为60%，空载及共转组（过表达CDX2和干扰miR-32组）均为100%。4组相比较，干扰CDX2组肿瘤的成瘤时间、生长速度均明显快于其他三组，体积和质量也较另三组明显增大（P<0.05）。相反，过表达CDX2组肿瘤的成瘤时间、生长速度均明显慢于其他三组，体积也较另三组明显减小（P<0.05），抑瘤率为65.3%，而共转组与对照组比较，肿瘤的生长速度和体积无统计学意义（抑瘤率11.1%，P>0.05）。RT-PCR检测结果提示，干扰CDX2组胃癌移植瘤CDX2 mRNA和miRNA-32表达明显下调，而CDX2过表达组CDX2 mRNA和miRNA-32表达较对照组明显上调，两者在体内亦存在正相关。然而，共转组移植瘤组织中CDX2 mRNA表达明显上调，miRNA-32的表达明显下调。Western blot检测结果显示，与对照组比较，干扰CDX2下调miRNA-32表达后，移植瘤组织中E-cadherin表达减低、Vimentin表达升高，而过表达CDX2上调miRNA-32表达后，移植瘤组织中E-cadherin表达上调、Vimentin表达降低，差异均有统计学意义（均P<0.05）。而共转组与对照组比较，E-cadherin和Vimentin的表达变化无统计学意义。
　　结论：
　　1.胃癌患者术后组织标本中CDX2和miRNA-32表达下调与患者病情进展有关，CDX2蛋白阴性者预后更差，且更容易出现术后的短期复发。
　　2. CDX2体外直接调控miRNA-32的转录，并影响胃癌细胞增殖、迁移、侵袭以及EMT表型等生物学行为。
　　3.在裸鼠体内CDX2能正向调控miRNA-32表达影响胃癌移植瘤的生长并逆转胃癌EMT作用。

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中文摘要

英文摘要

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引言

英文摘要

第一部分 胃癌组织中CDX2和miRNA-32表达与临床病理参数及患者预后的关系

绪论

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 CDX2调控miRNA-32表达对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT表型的影响实验研究

绪论

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 CDX2调控miRNA-32表达对胃癌细胞裸鼠体内成瘤能力和EMT表型的影响体内研究

绪论

材料与方法

结果

讨论

参考文献

全文总结

综述;外周血microRNA检测在胃癌早期诊断中的临床应用进展

攻读博士学位期间公开发表的论文及科研成果

英文缩写词表

致谢