基于荧光硅纳米颗粒的基因载体的构建及其在活细胞内的生物成像基础研究

摘要

随着纳米科学技术的飞速发展，各种各样的纳米材料被用于构建非病毒基因载体。其中，具有荧光性能的基因载体因为能够示踪细胞内基因运输的相关过程而倍受瞩目。在基因运输的过程中，长时程实时的示踪成像可以让人们更加综合地理解基因载体的胞内行为，进而有利于更加合理地设计高性能的基因载体。近年来，零维荧光硅纳米颗粒受到了人们的广泛关注。因其具备优越的光学性质和良好的生物安全性，被认为是生物成像应用中潜在的理想荧光探针。
　　在本文中，我们首先构建了一种基于荧光硅纳米颗粒的基因载体，并成功将其应用于基因运输和荧光生物成像。在DNA的负载和保护试验中，基于荧光硅纳米颗粒的基因载体不仅具有相对较高的DNA负载率，而且能够有效地保护DNA，避免DNA酶的降解。在基因转染测试中，基于荧光硅纳米颗粒的基因载体在人宫颈癌(HeLa)细胞的基因转染效率约为35％，比相同条件下聚乙烯亚胺(Polyetherimide，PEI)的转染效率要高。基于荧光硅纳米颗粒的基因载体同时也具备良好的生物安全性，在与HeLa细胞共孵育培养时间长达24和48小时的时间内，均未产生明显的细胞毒性，HeLa细胞仍然维持90％以上的存活率。
　　其次，通过追踪荧光硅纳米颗粒强而稳定的荧光，我们长时程实时地研究了基因载体的胞内行为（比如:细胞内吞、胞内转运等），进而揭示了基因载体与溶酶体的“复融合”（re-fusion）现象。我们选择了另外一种典型的人乳腺癌(MCF-7)细胞作为对照组来研究载体的基因转染和胞内行为。基于荧光硅纳米颗粒的载体在MCF-7细胞中的基因转染效率约为16％，比相同实验条件下HeLa细胞的转染效率小的多。在活细胞长时程实时的示踪成像中，MCF-7细胞中同样存在基因载体与溶酶体的“复融合”现象。在相同的时间内（15分钟的实时示踪成像），基因载体与溶酶体的“复融合”在MCF-7细胞中发生了3次，而在HeLa细胞中仅发生了1次。最后，通过进一步分析此两种细胞系的基因转染效率和胞内基因载体与溶酶体“复融合”现象之间的关系可知，“复融合”现象在基因转染效率低的MCF-7细胞中比在基因转染效率高的HeLa细胞中发生的次数更多。
　　综上可知，基于荧光硅纳米颗粒的基因载体不仅具有强而稳定的荧光和良好的生物安全性，而且具有相对较高的DNA负载和基因转染能力。利用其优异的光学性质，本文进一步研究了基因载体的胞内命运。这些结果表明基于荧光硅纳米颗粒的基因载体有望作为具有荧光性能的新型基因载体应用于活细胞内长时程实时的示踪成像，并为人们提供更加有价值的信息来深入地了解和研究基因载体的胞内行为。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 基因治疗

1．2 非病毒基因载体

1．2．1 阳离子脂质体基因载体

1．2．2 阳离子聚合物基因载体

1．2．3 纳米材料基因载体

1．3 基于荧光硅纳米颗粒的生物探针在长时程细胞成像上的应用

1．4 本文的研究意义及主要研究内容

1．4．1 立题依据及意义

1．4．2 主要研究内容

参考文献

第二章 基于荧光硅纳米颗粒基因载体的制备与表征

2．1 前言

2．2 实验部分

2．2．1 试剂与仪器设备

2．2．2 荧光硅纳米颗粒的制备

2．2．3 基于荧光硅纳米颗粒的基因载体的制备

2．2．4 基于硅纳米颗粒的基因载体的表征

2．2．5 质粒的制备

2．2．6 基因载体对DNA的负载

2．2．7 基因载体对DNA的保护

2．3 结果与讨论

2．3．1 基于硅纳米颗粒的基因载体的表征

2．3．2 基因载体对DNA负载能力的测试

2．3．3 基因载体对DNA保护能力的测试

2．4 结论

参考文献

第三章 基于荧光硅纳米颗粒基因载体的细胞转染和活细胞示踪

3．1 前言

3．2 实验部分

3．2．1 试剂与仪器设备

3．2．2 细胞培养

3．2．3 基因载体的细胞毒性

3．2．4 基因转染

3．2．5 荧光追踪细胞在不同时间段对载体的摄取情况

3．2．6 活细胞中长时程实时的示踪成像

3．3 结果与讨论

3．3．1 细胞毒性和基因转染效率的评估

3．3．2 细胞对载体的摄取

3．3．3 基因载体的胞内行为

3．3．4 基因载体与溶酶体的相互作用

3．4 结论

参考文献

第四章 论文总结与展望

4．1 论文总结

4．2 展望

攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文

致谢