血栓调节蛋白对肺癌细胞致瘤性和迁移的抑制作用及其机制

摘要

血栓调节蛋白（Thrombomodulin，TM）是血管内皮细胞膜蛋白，在抗血栓、抗炎症、血管保护等方面具有重要作用，被称为是“血管保护神”。近年来有文章报道，TM在肺癌等多数肿瘤组织中被下调，且其表达水平下调与肿瘤患者预后差相关。然而血栓调节蛋白在肺癌细胞中的作用机制还不完全清楚。阿托伐他汀钙（atorvastatin，ATV），是用于降低胆固醇的药物，目前仅有少数文章发现在人主动脉内皮细胞中，ATV可使TM表达升高，但在肺癌中ATV是否促进肺癌细胞TM表达还没有报道。因此，我们用不表达TM的肺癌细胞为模型，用不同浓度的ATV对SPC-A-1进行处理。结果表明，ATV可以诱导TM基因高表达，并能抑制SPC-A-1的克隆形成能力，揭示ATV降低肺癌细胞的致瘤性。
　　本研究将TM的cDNA稳定转入两株不表达TM的肺癌细胞95D和SPC-A-1，使TM在细胞中稳定高表达。结果表明，TM高表达显著降低肺癌细胞的生长能力，将细胞周期阻滞在G0/G1期；并且有效降低肺癌细胞的克隆形成能力。此外，TM过表达可以有效抑制肺癌细胞的迁移侵袭能力。分子机制研究发现，TM可以提高E-cadherin并降低N-cadherin的表达量，提示TM使EMT发生逆向改变，从而降低肺癌细胞的致瘤性。同时，我们将表达TM的A549肺癌细胞用TM shRNA沉默掉，发现TM抑制后，A549的迁移及侵袭能力增强，E-cadherin的表达量降低，N-cadherin的表达量升高。研究结果表明，ATV可能通过使TM高表达发挥抗癌作用。在肺癌的发生和发展过程中，TM可能是一个抑癌蛋白，这为以后在临床上进行TM基因治疗和采用ATV进行抗肺癌治疗，提供了新的策略和手段。

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一、前言

1、肺癌与肺癌发病机制及其治疗

2、TM与肿瘤发生及转移

3、TM与EMT

4、阿托伐他汀钙

5、本课题拟解决的科学问题和研究策略

二、材料与方法

（一）材料

1、细胞系

2、主要实验药物

3、主要抗体

4、主要仪器

5、主要试剂

（二）方法

1、主要试剂的配制

2、95D-V,95D-TM, SPC-V,SPC-TM四种细胞系的建立

3、ATV药物的配制与稀释

4、细胞培养

5、细胞转染

6、磷酸钙沉淀法制备TM shRNA病毒

9、shRNA介导的TM基因沉默

10、瑞姬氏染色

11、体外细胞形态实验

12、细胞免疫荧光

13、体外细胞增殖实验

14、TM对肺癌细胞周期的作用

15、软琼脂法集落形成实验

16、TM对肺癌细胞迁移的作用

17、TM对肺癌细胞体外侵袭的作用

18、TM对肺癌细胞基因表达的影响

19、TM对肺癌细胞相关蛋白表达的作用

20、统计学分析

三、结果

一、ATV(atorvastatin)诱导TM在肺癌细胞中的表达

1.1、ATV (atorvastatin)诱导TM在肺癌细胞中的表达

1.2、ATV可以降低95D和SPC-A-1肺癌细胞的致瘤性

二、TM(thrombomodulin)过表达及沉默肺癌细胞株模型的建立

2.1、TM过表达肺癌细胞模型的建立

2.2、TM shRNA沉默肺癌细胞模型的建立

三、TM(thrombomodulin)过表达及沉默对肺癌细胞株功能的研究

3.1、TM对肺癌细胞形态学的影响

3.2、TM对肺癌细胞生长的影响

3.3、TM对肺癌细胞周期的影响

3.4、TM对肺癌细胞致瘤性的影响

3.5、TM对肺癌细胞迁移的影响

3.6、TM对肺癌细胞侵袭的影响

四、TM(thrombomodulin)作用机制的研究

1、TM调节EMT的相关基因

2、TM对细胞周期的相关基因的作用

3、TM对细胞蛋白的影响

四、讨论

五、小结

参考文献

综述:OncomicroRNAs-mediated tumorigenesis: implication in cancer diagnosis and targeted therapy

攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文

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