短梗五加果抗炎活性成分及其药物动力学研究

摘要

短梗五加Acanthopanax sessiliflorus( Rupr. Et. Maxim) Seem.为五加科五加属植物，主产于中国，韩国和日本等地，具有滋补强壮、祛风除湿的功效。短梗五加果为短梗五加的成熟干燥果实，本文对短梗五加果的化学成分、抗炎活性和主要活性成分的药物动力学进行了研究。
　　采用大孔吸附树脂柱色谱、硅胶柱色谱、Sephadex-LH20柱色谱、ODS开口柱色谱及制备-HPLC等分离手段从短梗五加果甲醇提取物中分离得到了44个化合物，通过理化性质、1D-NMR、2D-NMR、MS等光谱手段，对42个化合物进行了鉴定。其中三萜类化合物10个：分别为3-oxo-24-methylenecycloartan(1)，甘五酸(2)，异五味子酸(3)，白桦脂醇(4)，白桦脂酸(5)，五加苷K(6)，22-α-hydroxychiisanogenin(7)， chiisanogenin(8)，22α-hydroxychiisanoside(9)，(1R,11α)1,4-epoxy-11-hydroxy-3,4-secolupane-20(30)-ene-3,28-dioic acid(10)；甾体类化合物1个：豆甾醇(11)；黄酮类化合物4个：分别为isooirenitn(12)，芦丁(13)，异鼠李素-3-O-芸香糖苷(14)，儿茶素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖(15)；紫罗兰酮类化合物3个：分别为icariside B1(16)， icariside B2(17)，(6R,7E,9R)-9-hydorxy-4,7-megastigmadien-3-one9-O-β-D- apiofuranosyl-(1-6)-β-D--glucopyranoside(18)；木脂素类化合物7个：分别为(+)-l- hydroxypinoresinol-l-O-β-D-glucoside(19)；苯甲酸类：(7S,8R) dihydrodehydrodiconiferyl alcohol4-O-β-D-glucopyranoside(20)，蛇菰宁(21)， berchemol-4'-O-β-D-glucoside(22)，落叶松脂醇-4,4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(23)， icariside E3(24)，(75,8R)赤型-7,9,9'-三羟基-3,3'二甲氧基-8-O-4'-新木脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷(25)；苯丙素类化合物6个：分别为coniferin(26)，4-O-(2-O-β-D-glucopyranosyl-1-hydroxymethylethly)-dihydroconiferyl alcohol(27)，1-烯丙基-3-甲氧基-6-O-β-D-呋喃芹糖(1''-6')-β-D-吡喃葡萄糖苷(28)，hovetrichoside G(29)，eugenylβ-rutinoside(30)，3-甲氧基苯丙烯醇-4-O-β-D-葡萄糖苷(31)；酚酸类化合物6个：分别为香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷(32)，红景天苷(33)，4-羟基苯基苄基-β-D-葡萄糖苷(34)，4-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3,5-二甲氧基没食子酸(35)，香子兰酸酯葡萄糖苷(36)，2-羟基-5-(2-羟乙基)苯-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(37)；含氮类化合物5个：分别为川芎哚(38)，3-羧基川芎哚(39)，腺苷(40)，1-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid(41)，3-羟基-L-脯氨酸(42)。化合物2,3,14,18,19,23,24,25,27,28,31,37,41,42为首次从五加属Acanthopanax中分离得到；化合物6,13,16,17,22,32,39为首次从该植物Acanthopanax sessiliflorus中分离得到。
　　通过建立脂多糖诱导小鼠单核巨噬细胞 RAW264.7细胞释放炎症因子模型对短梗五加果进行抗炎评价。首先，采用MTT法测定了短梗五加果甲醇提取物乙酸乙酯层和正丁醇层部位对RAW264.7细胞的毒性影响，筛选出合适的梯度浓度（50、100、200 mg/L）进行给药，采用Griess法考察了乙醇提取物乙酸乙酯层和正丁醇层部位分别对LPS诱导RAW264.7细胞NO释放的影响，结果发现，正丁醇部位的抗炎活性明显优于乙酸乙酯层。其次，我们挑选了从正丁醇部位分离得到的5个三萜类化合物（化合物5,6,7,8,10）进行同样方法的体外抗炎活性研究。结果表明5,6,10具有明显的抗炎活性，其中化合物10的抗炎活性最佳。因此，我们从分子水平进一步考察了化合物10抗炎的机制，本实验选定iNOS和COX-2作为考察指标，通过Western Blot和PCR技术检测iNOS和COX-2的表达，进一步验证此结果。LPS诱导RAW264.7细胞后，iNOS和 COX-2的蛋白和 mRNA水平表达显著升高，而给药组其蛋白和mRNA表达则明显降低。这些结果表明化合物10可减少LPS诱导的NO的分泌，其作用机制主要是通过减低iNOS和COX-2基因表达。
　　建立了测定大鼠血浆中四种三萜类成分的UPLC-ESI-MS/MS分析方法。采用液-液萃取法进行血浆样品预处理，色谱柱为 ACQUITY UPLCTM BEH C18 column(1.7?m,50mm×2.1mm, i.d)；流动相为5mmol/L醋酸铵水溶液-乙腈(10:90，v/v)，等度洗脱；采用负离子检测方式，MRM扫描模式。利用该法分别研究了大鼠灌胃给予高、中、低3个剂量的4种三萜类化合物[22-α-hydroxychiisanogenin, chiisanogenin,(1R,11α)1,4-epoxy-11-hrdroxy-3,4- secolupane-20(30)-ene-3,28-dioic acid和22-α-hydroxychiisanoside]和相当于短梗五加果70％乙醇提取物后的药物动力学行为。统计学检验结果表明，在所研究的剂量范围内，4种三萜类化合物在大鼠体内呈线性药物动力学特征。与给药4种单体相比，给药短梗五加果70%乙醇提取物后的 AUC0-t降低 P(<0.05)；大鼠血浆中22-α-hydroxychiisanogenin和chiisanogenin的药-时曲线出现双吸收峰现象。
　　建立了同时测定大鼠血浆中原儿茶酸（PCA），东莨菪苷，(-)-松脂醇-4,4’-di-o-β-D-吡喃葡萄糖苷（PDG），短梗五加苷D，短梗五加苷B和金丝桃苷的UPLC-MS/MS分析方法。采用液-液萃取法进行血浆样品预处理,色谱柱为采用Agilent SB-C18 column C18色谱柱(1.7?m,100 mm×2.1 mm, i.d.);流动相为甲醇-0.1%甲酸水，质谱采用多反应监测（MRM）模式在负离子模式下进行检测。方法线性良好,日内、日间精密度、准确度、提取回收率和稳定性均符合生物样品测定要求。利用该方法对大鼠灌胃给予短梗五加果70%乙醇提取物后的药物动力学行为进行研究,为短梗五加果的临床应用以及给药方案的设计提供参考。提供了各成分的药动学参数。原儿茶酸，东莨菪苷，(-)-松脂醇-4,4’-di-o-β-D-吡喃葡萄糖苷，短梗五加苷D，短梗五加苷B和金丝桃苷的Cmax分别为198.1±60.3 ng/mL,734.1±203.4 ng/mL,447.1±104.5ng/mL,356.7±145.2ng/mL,409.5±133.2ng/mL,103.7±46.3ng/mL;Tmax分别为1.5±0.5 h,0.5±0.3 h,1.0±0.4h,0.5±0.3h,0.5±0.2 h,0.25±0.3 h。

目录

声明

前言

第一章 刺五加属的研究进展

1 简介

2五加属植物的化学成分

3 药理作用和临床应用

4 立题目的与依据

参考文献

第二章 短梗五加果化学成分分离与鉴定

1 仪器与试药

2 提取与分离

3 结构鉴定

参考文献

第三章 三萜类化合物的抗炎作用研究

第一节 正丁醇层和乙酸乙酯层提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放活性的影响

第二节 5种三萜类化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放活性的影响

参考文献

第四章 大鼠血浆中4种三萜皂苷的含量测定及药动学研究

1 仪器与试药

2 溶液的配制

3 血浆样品分析方法的建立

4 血浆样品分析方法验证

5 四种三萜类化合物在大鼠体内的药物动力学

6 讨论

参考文献

第五章 HPLC-MS/MS法测定大鼠口服短梗五加果提取物六种木脂素和酚酸类成分

1 仪器与试药

2 溶液的配制

3 血浆样品分析方法的建立

4 血浆样品分析方法验证

5 六种木脂素和酚酸类化合物在大鼠体内的药物动力学

6 结论

7 讨论

参考文献

第六章 结论

攻读博士期间发表的论文

英汉缩略语对照表

附图

致谢