不同直径左旋聚乳酸纤维支架及其极化巨噬细胞对大鼠骨髓间充质干细胞神经分化的影响

摘要

第一部分大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离与鉴定
　　目的：从大鼠股骨、胫骨分离提取骨髓间充质干细胞，进行培养纯化、免疫表型鉴定，为骨髓间充质干细胞负载于静电纺丝纤维支架成神经分化提供研究手段。
　　方法：选取100-150g左右的SPF级SD大鼠，在无菌条件下，应用贴壁分离法提取骨髓间充质干细胞，并运用细胞常规培养、传代技术对骨髓间充质干细胞进行纯化。培养至第三代时，应用细胞流式检测技术对其进行CD34、CD45、CD29、CD90表型测定。
　　结果：原代提取的骨髓间充质干细胞培养24h后，光镜下观察部分细胞贴壁，细胞形态呈球形长梭形和纺锤形，其余尚存大量悬浮红细胞。换液培养至第7天时，贴壁细胞融合率达80％-90%后，胰酶消化离心、重悬进行1:2传代接种，3-4小时观察细胞开始贴壁，第3天时，融合率可达80%以上，出现“细胞边缘现象”。培养至第三代，对其进行流式细胞检测，CD29和CD90呈阳性结果，而CD34和CD45呈阴性。
　　结论：成功应用贴壁分离方法提取纯度较高，均一稳定的大鼠骨髓间充质干细胞。
　　第二部分不同直径左旋聚乳酸静电纺丝纤维支架的制备及性能检测
　　目的：运用静电纺丝技术，将不同质量的聚乳酸制备成不同直径的聚乳酸纤维支架，并对不同直径纤维支架进行材料分析，为开展进一步的实验研究提供研究手段。
　　方法：将不同质量0.75g、1g、1.5g、2.0g聚乳酸固体颗粒在二氯甲烷（DCM）和二甲基甲酰胺(DMF)中溶解，制备成浓度（质量比 w/w）为6.25wt%、8.33wt%、12.5wt%、16.67wt%的混合溶液，应用静电纺丝设备制备成不同直径的左旋聚乳酸纤维支架，并应用扫描电镜（SEM）、粒径分析、水接触角（WCA）对该生物支架材料进行检测。
　　结果：通过扫描电镜和粒径分析技术对不同直径左旋聚乳酸纤维支架进行测定，纤维支架平均直径分别为710±154nm、1000±221nm、1560±170nm、2060±128nm，聚乳酸混合溶液的浓度变化与纤维支架直径呈正比关系。应用水接触角检测，显示四种不同直径的纤维支架水接触角小于90°，皆属于亲水性生物支架材料，适合负载细胞进行后续试验。
　　结论：成功利用静电纺丝技术制备四种不同直径左旋聚乳酸纤维支架支架。
　　第三部分不同直径左旋聚乳酸纤维支架对巨噬细胞极化的影响
　　目的：研究巨噬细胞在不同直径左旋聚乳酸纤维支架上接种后极性的改变，为后续巨噬细胞极化影响大鼠骨髓间充质干细胞成神经分化研究做准备。
　　方法：对1、3、5天培养于不同直径纤维支架的RAW264.7细胞进行qRT-PCR检测，测定RAW264.7细胞极化相关mRNA表达；利用ELISA技术测定上清中细胞因子IL-1β、TGF-β含量；运用流式细胞检测技术测定细胞表型改变。
　　结果：对1、3、5天培养在不同直径纤维支架上 RAW264.7细胞进行实时定量PCR检测(qRT-PCR分析)，在相同时间情况下，不同直径纤维支架各基因表达量对比,结果显示M1相关基因表达呈上升趋势，在第5天直径1000nm纤维支架表达最高，而M2相关基因在第1天2060nm纤维支架表达最高，后逐渐呈下降趋势。ELISA检测细胞上清，结果显示M1相关因子IL-1β在第5天1000nm纤维支架上清中含量最高；M2相关因子TGF-β在第1天2060nm纤维支架上清中含量最高。流式细胞术测定不同直径纤维支架第1天RAW264.7细胞表型，显示 F4/80和CD11b高阳性率表达；M1型表型 CD16/32阳性率明显低于M2型特征表型CD206阳性率。
　　结论：巨噬细胞培养于不同直径左旋聚乳酸纤维支架，在第1天时有向M2型极化的趋势，之后随时间逐渐向M1型极化。故分别收集对M1和M2型极化程度最强的1000nm和2060nm两种直径纤维支架上清，为进一步研究巨噬细胞极化对BMSCs成神经分化影响提供物质基础。
　　第四部分不同直径左旋聚乳酸纤维支架对大鼠骨髓间充质干细胞神经分化影响
　　目的：通过将大鼠骨髓间充质干细胞负载于不同直径纤维支架并对其诱导成神经分化，分析和评价纤维支架直径对骨髓间充质干细胞成神经分化影响。
　　方法：将前述通过全骨髓贴壁法分离纯化的大鼠 BMSCs，按每40000/cm2细胞量接种到不同直径左旋聚乳酸纤维支架上，待各组细胞融合率达80%时，加入预诱导液和诱导液，通过免疫荧光技术,对诱导分化后BMSCs进行神经元特异性（NF-200、NSE）抗原荧光染色。qRT-PCR技术检测成神经诱导分化后，神经元细胞基因表达情况，平行设阳性对照组（直接种植在细胞培养板上）及阴性对照组（未诱导）。
　　结果： NF-200、NSE和 DAPI染色显示各神经元特异性抗原呈阳性表现；qRT-PCR定量检测NF-200、MAP-2、Nestin和NSE基因在实验组中710nm纤维支架表达量明显高于其他直径纤维支架。
　　结论：制备的四种不同直径左旋聚乳酸纤维支架可负载并促进大鼠骨髓间充质干细胞成神经分化，其中直径为710nm的纤维支架更适合BMSCs成神经分化。
　　第五部分巨噬细胞极化上清对骨髓间充质干细胞神经分化影响
　　目的：探讨不同直径的左旋聚乳酸静电纺丝纤维支架使巨噬细胞极化后的培养上清对骨髓间充质干细胞成神经分化的影响。
　　方法：将骨髓间充质干细胞按每40000/cm2细胞量接种于24孔板中，融合率达80%以上时，加入预诱导液24小时后，用第三部分1000nm和2060nm纤维支架培养RAW264.7细胞1、3、5天上清联合诱导液按1:4比例对骨髓间充质干细胞进行成神经诱导。采用倒置显微镜、免疫荧光染色和qRT-PCR技术对所诱导细胞进行检测。
　　结果：骨髓间充质干细胞经预诱导24小时后，显微镜下观察可见胞质向细胞核收缩，有短触角生成；诱导液联合RAW264.71、3、5天上清液诱导后，大多数细胞呈神经元样细胞，胞体为圆形或者椭圆形，胞体周围突起较长，末端产生分支与周围细胞连接成网。免疫荧光染色计数神经元特异性抗原阳性细胞数并作统计学分析，显示在第1天时直径为2060nm纤维支架NSE、NF-200、MAP-2阳性率最高分别为79%、64%、81%。qRT-PCR检测，显示第1天直径为2060nm纤维支架上清对BMSCs成神经诱导分化后，神经元基因表达最强。
　　结论：静电纺丝纤维支架可调控RAW264.7细胞极化方向，且第1天直径2060nm纤维支架可促使巨噬细胞向M2型极化，分泌TGF-β等细胞因子，更有效促进BMSCs成神经分化。从免疫调控角度间接证明静电纺丝纤维支架对BMSCs有成神经分化有促进效果。

目录

声明

前言

参考文献

第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离与鉴定

引言

1.材料与仪器

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

参考文献

第二部分 不同直径左旋聚乳酸纤维静电纺丝支架的制备及性能检测

引言

1.材料与仪器

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

参考文献

第三部分 不同直径左旋聚乳酸纤维支架对巨噬细胞极化的影响

引言

1.材料与仪器

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

参考文献

第四部分 不同直径左旋聚乳酸纤维支架对大鼠骨髓间充质干细胞神经分化影响

引言

1.材料与仪器

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

参考文献

第五部分 巨噬细胞极化上清对骨髓间充质干细胞神经分化影响

引言

1.材料与仪器

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

参考文献

结论与展望

结论

展望

综述:静电纺丝技术在神经组织再生中研究进展

中英文对照缩略词表

附录

硕士研究生期间完成的论文

致谢