丝胶蛋白作为血清替代物或添加物在细胞培养和冻存中应用与评估

摘要

近年来，随着细胞培养技术的不断发展，胎牛血清（FBS）的不足日渐显现。胎牛血清不仅价格昂贵而且病毒感染会带来生物安全性问题。所以，有关血清替代物的研究与开发越来越受到人们的重视。在茧丝加工行业中通常被作为废弃物的丝胶蛋白具有抗紫外线、抗氧化、保湿等活性，而且因其良好的生物学相容性常被用作护肤、护发化妆品和医用生物材料如3D支架、表面改性材料等。本文以家蚕的茧壳为实验材料，脱胶后采用蛋白酶水解和碱性物质水解的方法制得了两种丝胶肽及其水解物，分别简称为丝胶酶水解物和丝胶碱水解物。首先，作者探讨了这种酶水解物对小鼠成纤维细胞（L929），四种肿瘤细胞（7402、A549、HepG-2、MCF-7）和杂交瘤细胞（3C2）生长的影响。其次，利用丝胶蛋白的碱水解物对L929细胞的活力和周期、胶原蛋白分泌的影响进行了研究和分析。同时还系统性地评估了这种丝胶蛋白对中国仓鼠卵巢细胞（CHO）、人宫颈癌细胞（Hela）的生长、增殖、周期分布及相关基因表达的影响。最后，还初步评估了丝胶蛋白的酶水解物对L929细胞及大鼠胰岛细胞冻存的影响。
　　本论文的研究主要涉及以下四个方面：
　　（1）细胞培养时常需加入动物血清等补充剂，不仅导致培养成本的飙升而且培养基成分复杂，还会给细胞培养带来一些不必要的病毒感染风险。所以，有关血清替代物的研究成为一个颇具科研价值的课题。本研究主要利用丝棉加工废液中膜滤回收到的丝胶蛋白，再经过酶解而获得分子量分布范围都少于30kDa的三种丝胶肽及其水解物。通过将丝胶酶水解物额外添加于血清培养基或全部或部分替代血清的培养基进行L929、A549、7402、HepG-2、MCF-7和杂交瘤细胞的短期（1-4d）培养和试验。实验结果表明短期培养时，当0.75％丝胶的酶水解物额外加入到胎牛血清培养基中，L929的生长与增殖明显优于原血清培养基的培养；当丝胶的水解物全部代替胎牛血清加入到培养基后，这种细胞的存活率能够达到胎牛血清培养的三分之二左右；当培养基中加入六成胎牛血清和四成丝胶时，这种细胞的细胞存活率可以达到胎牛血清培养基的80%左右。细胞形态的显微观察显示，降解丝胶的分子量越小越适合于动物细胞的培养。另外，无论丝胶酶水解物的分子量范围大小，四种肿瘤细胞和一种杂交瘤细胞在替代血清的丝胶培养基上的生长与增殖都远优于胎牛血清培养基，这表明在肿瘤细胞A549、7402、HepG-2、MCF-7和杂交瘤细胞的培养基中，丝胶酶水解物在短期内可以完全替代动物血清进行更好的无血清细胞培养。所以，丝胶酶水解物在短期培养时，无论是额外添加还是部分替代时其分子量越小越有利于L929细胞的生长，蚕丝加工废液中膜滤回收的丝胶酶水解物在动物细胞短期的培养中具有潜在的开发价值和应用研究。
　　（2）应用替代血清培养的方式研究了丝胶酶水解物对L929长期（1-12d）培养的细胞活力和碱水解物对L929的活力细胞、周期及胶原蛋白表达的影响。实验结果发现，在长期培养时丝胶酶水解物全部替代胎牛血清后L929细胞的活力较差，达不到血清培养基的效果，这与上一章的初步研究的结果是一致的，但是可以绝大部分替换血清，即使在培养第9天的时候，胎牛血清与丝胶蛋白（1mg/mL）的比例为1:9的时候，其细胞活力仍然能达到胎牛血清的75.4%。而在碱水解物方面的实验表明，浓度为1mg/mL的丝胶蛋白更适合L929细胞的生长，当与上述相同的比例（1:9）长期培养到第16天的时候，其细胞活力高于上述酶水解物，达到胎牛血清的89.7%。在以下细胞周期和胶原蛋白含量测定的试验中都选用1mg/mL丝胶碱水解物进行。采用流式细胞仪进行细胞周期检测和分析，结果发现它的G0/G1、S、G2/M各群体细胞百分比是与胎牛血清组类似，说明部分替换胎牛血清的培养基培养对细胞的周期没有产生较大的变化，这表明在细胞遗传进程中没有产生有害的偏差。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测了L929细胞I型和III型胶原蛋白的分泌水平，结果表明其I型胶原蛋白的表达含量也有所上升，而I型与III型之间的比例值为2.84ng/mL高于胎牛血清的2.44ng/mL。以上研究结果表明，在胎牛血清与丝胶蛋碱水解物的比例为1:9时，其细胞的活力仍能达到胎牛血的80.0%以上，各个周期的百分比也类似于胎牛血清，I型与III型胶原蛋白的分泌之间的比例值为胎牛血清的1.2倍。因此我们推测，这种丝胶的碱水解物有可能被部分替代胎牛血清用于医疗美容等行业中成纤维细胞的培养。
　　（3）系统性地评估了丝胶碱水解物作为血清替代物在CHO细胞及Hela细胞中的作用。对这两种细胞的形态学、周期及相关基因的表达进行了分析和研究。实验结果发现，与在胎牛血清中培养的细胞相比，在丝胶碱水解物全部替代组中培养的细胞可以显示与其类似的细胞形态，特别是15μg/mL第五天的时候两种细胞都显示了更加密集的状态。丝胶碱水解物显示了相似或者更高的细胞总生存率，尤其是在15μg/mL第五天的时候CH0细胞的吸光度值达到了0.85高于胎牛血清组的0.75，而Hela细胞的吸光度值则达到1.44高于胎牛血清组的1.24。在周期方面，丝胶碱水解物具有更高百分比的S期和相似G2/G1比例，尤其是第5天的时候CHO细胞的S期的比例为28.9%接近胎牛血清组14.9%的2倍，Hela细胞的S期的比例为28.0%高于胎牛血清组的23.9%。在基因表达方面，通过RT-PCR发现两种培养基中细胞之间的差异表达主要富集于“抑制DNA结合（ID1、ID2）”，“细胞周期进程（FN1、MFSD4、MMP1）”和“细胞增殖和迁移（INHBA、LCN2、CBY1、CXCL12、SCNN1A）”等相关基因。其中在CHO细胞中CXCL12基因的相对表达上升至3.1倍，而在Hela细胞中LCN2基因的相对表达上升至2.75倍，表明这些相关的基因被激活以促进细胞生长和增殖。综上所述，在用15μg/mL的丝胶碱水解物替代胎牛血清的培养基中，两种细胞都显示了类似的细胞形态，相似或者更高的细胞总生存率，以及具有更高百分比的S期（28.0%以上）和相似的G2/G1期的比例。相关基因如（CXCL12、LCN2）等被成倍地（3.1倍、2.75倍）激活，呈现了相当或更好的细胞生长和增殖状态。这充分说明这种丝胶碱水解物在CHO细胞及Hela细胞的培养中可以完全替代胎牛血清。
　　（4）无血清冻存的实验结果初步表明，丝胶酶水解物对小鼠成纤维细胞和大鼠的胰岛细胞的冻存和保护是有利的，尤其是小分子的丝胶酶水解物（10kDa以下）在10mg/mL浓度时可以促进小鼠成纤维细胞的胶原蛋白的分泌水平和大鼠胰岛细胞的胰岛素的分泌含量。ELISA试验发现这种小分子的丝胶酶水解物能促进胶原分泌的表达量，最高达到了21ng/mL高于胎牛血清组的17ng/mL；能刺激胰岛素的分泌，其含量最高为34ng/mL，稍高于胎牛血清组的32ng/mL，上述结果初步表明，酶水解物（10mg/mL）可以完全替代血清应用于小鼠成纤维细胞和大鼠胰岛细胞的无血清冻存培养，而具体的刺激机制还有待今后进一步的研究与探讨。
　　综上所述，本文详细地研究了丝胶蛋白在两种不同的方法降解后对细胞的无血清培养及冻存的影响。本文的研究结果不仅使我们可以对丝胶蛋白替代胎牛血清进行多种细胞的培养有更多的了解，而且也表明小分子量的丝胶蛋白在低浓度时就能部分替代胎牛血清或额外添加于胎牛血清培养基中进行动物细胞的培养。这为在蚕丝工业化生产中常作为废弃物的丝胶蛋白进行回收和纯化，并作为细胞培养的基质和医用生物材料提供了潜在的新途径，这不但可以极大的减少蚕丝加工的水体污染、改善环境，而且可以大大地降低细胞培养及冻存的工程成本和生物安全性风险，为丝胶蛋白高附加值的开发与应用和蚕丝业的可持续发展打下一个良好的基础。

目录

声明

第一章 文献综述

1、丝胶蛋白概况

2、丝胶蛋白用于细胞培养与冻存的概况

3、本论文的研究目的和研究内容

参考文献

第二章 丝胶酶水解物的制备及其血清替代效果的初步评估

1、前言

2、实验材料、试剂与主要仪器

3、实验技术方法

4、实验结果与分析

5、讨论

6、结论

参考文献

第三章 丝胶水解物对细胞的活力、周期及相关蛋白的影响

1、前言

2、实验材料、试剂和主要仪器

3、实验技术与方法

4、实验结果与分析

5、讨论

6、结论

参考文献

第四章 丝胶碱水解物作为血清替代物对CHO及Hela细胞的系统性评估

1、前言

2、实验材料、试剂和主要仪器

3、实验技术与方法

4、实验结果与分析

5、讨论

6、结论

参考文献

第五章 丝胶酶水解物作为血清替代物在细胞冻存中效果的初步评估

1、前言

2、实验材料、试剂和主要仪器

3、实验技术与方法

4、实验结果与分析

5、讨论

6、结论

参考文献

攻读博士学位期间公开发表的论文

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