脊髓损伤后Mst-1敲除提高自噬流保护脊髓运动神经元的作用和机制

摘要

脊髓损伤(spinal cord injury)是一种严重的中枢系统疾病，可导致患者的运动感觉障碍，并影响患者的心血管、消化、排尿等多个系统的功能，而严重的脊髓损伤可导致患者损伤平面以下感觉和运动功能的完全丧失。脊髓损伤不仅给患者及家人的身心带来极大的痛苦，也给社会造成了大量的劳动力流失，因而成为亟待攻克的医学难题，迫切需要寻找有效的治疗方法。
　　脊髓损伤的病理发生发展过程复杂，一般认为，急性脊髓损伤包括原发性脊髓损伤和继发性脊髓损伤。原发性损伤在事故发生时即刻发生，导致损伤部位的神经元直接死亡。而继发性损伤包括局部缺血缺氧、氧化应激、离子稳态改变以及免疫反应等等，这些广泛持续的病理性压力最终导致原发性损伤部位周围的神经元死亡，运动功能进一步丧失，以及脊髓损伤康复的延迟。然而继发性损伤的过程又是可逆性和可调控性的。因此，虽然我们无法改变原发性损伤的发生，而在继发性脊髓损伤发生发展的过程中，我们可以避免损伤部位细胞内外环境的继续恶化。因此对继发性脊髓损伤病理反应和机制的研究对脊髓损伤后神经的修复和再生具有非常重要的意义。
　　自噬(autophagy)翻译自希腊语auto(自己)和phagein(吃)，意味着“自己吃自己”。它是一种保守的细胞分解代谢过程，细胞通过这个复杂的自噬-溶酶体途径回收利用大分子以及一些受损的细胞器，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。自噬可以在机体能量缺乏及缺血缺氧的情况下被快速诱导，它是细胞受损后有害蛋白积累，最先被诱导的细胞的存活机制之一。而在脊髓损伤中,自噬可能参与到脊髓的继发性损伤中，因此，近年来，越来越多的研究集中到脊髓损伤后自噬的发生发展及其作用机制中。
　　哺乳动物STE20样的丝-苏氨酸蛋白激酶（Mst-1）是Hippo信号通路的一个重要上游分子，参与病理性压力反应并调节细胞死亡。最近的研究表明，Mst-1是参与某些神经病变的重要分子，如肌萎缩侧索硬化症等。内源性Mst-1通过抑制自噬，从而加速病理性压力反应下的神经细胞死亡。而基因敲除Mst-1通过促进自噬，从而有利于肌萎缩侧索硬化症的脊髓运动神经元及心肌梗死后的心肌细胞存活。综上所述，Mst-1是参与病理性压力、细胞死亡、自噬发生的一个关键分子。然而Mst-1在脊髓损伤中的作用尚不十分清楚，因此我们提出假设，探讨基因敲除Mst-1是否可以通过在脊髓损伤早期提高自噬流的方式降解有毒有害物质，从而减少脊髓继发性损伤的病理性压力，并最终减少神经元的死亡，从而为损伤后突触重建及运动功能的恢复打下良好的基础。
　　第一部分、脊髓损伤后Mst-1敲除提高自噬流保护脊髓运动神经元的作用研究
　　目的：哺乳动物STE20样的丝-苏氨酸蛋白激酶（Mst-1）是Hippo信号通路的一个重要的上游分子，是参与病理性压力、细胞死亡、及自噬发生的一个关键分子。有研究表明，基因敲除Mst-1有利于肌萎缩侧索硬化症的脊髓运动神经元及心肌梗死后的心肌细胞存活。然而Mst-1在脊髓损伤中的作用尚不十分清楚。第一部分旨在探讨基因敲除Mst-1对脊髓损伤模型小鼠的作用。
　　方法：
　　1.对4-6周龄的雌性野生型C57BL/6J小鼠，及雌性C57BL/6J遗传背景的Mst-1基因敲除小鼠（Mst-1-/-）行脊髓胸9节段（T9）的全横断模型。
　　2.利用蛋白免疫印迹的方法检测脊髓损伤4周的野生型小鼠和未损伤的野生型小鼠的损伤部位，Mst-1和p-Mst-1的表达变化。
　　3.利用免疫荧光的方法将Mst-1和p-Mst-1分别与ChAT共染，检测ChAT阳性运动神经元中Mst-1和p-Mst-1的表达变化。
　　4.对损伤后4周的Mst-1-/-小鼠和Mst-1+/+小鼠行脊髓头端600μm至脊髓尾端600μm的连续冠状切片，并共染ChAT和GFAP，以检测基因敲除Mst-1后脊髓运动神经元的数量变化情况。
　　5.利用荧光金逆行标记的方法检测损伤后4周的Mst-1-/-和Mst-1+/+小鼠中，与肌肉存在支配联系的运动神经元的数量变化情况。
　　6.利用BMS评分量表评价Mst-1-/-和Mst-1+/+小鼠后肢运动功能的恢复情况。
　　7.利用免疫荧光的方法将ChAT和vGlut1共染，以检测脊髓损伤9周后，脊髓水平的ChAT阳性运动神经元与谷氨酸能中间神经元形成的谷氨酸能突触的数量变化情况。
　　结果:
　　1.我们成功建立了T9小鼠的脊髓损伤模型。
　　2.蛋白免疫印迹的结果显示，损伤组与未损伤组小鼠损伤部位的Mst-1总蛋白的表达水平没有显著性差异，而Mst-1的激活形式p-Mst-1的表达显著上调。
　　3.免疫荧光的结果显示，损伤组与未损伤组小鼠ChAT阳性神经元中Mst-1总蛋白的表达水平没有显著性差异，而Mst-1的激活形式p-Mst-1的表达显著上调，且p-Mst-1特异性的表达在ChAT阳性神经元中。
　　4.免疫荧光的结果显示，损伤后4周，与Mst-1+/+组相比，Mst-1-/-组脊髓头端200μm至脊髓尾端200μm的ChAT阳性神经元数量增加，说明基因敲除Mst-1可以保护损伤后的运动神经元。
　　5.荧光金逆标的结果显示，损伤后4周，与Mst-1+/+组相比，Mst-1-/-组脊髓头端200μm至脊髓尾端200μm的FG阳性神经元数量增加，说明基因敲除Mst-1可以使与肌肉存在支配联系的运动神经元的数量增加。
　　6.BMS评分的结果显示，基因敲除Mst-1可以改善小鼠的后肢运动功能。
　　7.ChAT和vGlut1共染的结果显示，基因敲除Mst-1可以提高脊髓水平的ChAT阳性运动神经元与谷氨酸能中间神经元形成的谷氨酸能突触的数量。
　　结论：我们的结果表明，脊髓损伤可以诱导Mst-1的激活，基因敲除Mst-1可以保护损伤后的脊髓运动神经元、改善脊髓水平的谷氨酸能突触的形成以及小鼠的后肢运动功能。
　　第二部分、脊髓损伤后Mst-1敲除提高自噬流保护脊髓运动神经元的机制研究
　　目的：有研究表明，内源性Mst-1抑制自噬，而基因敲除Mst-1通过提高自噬流水平，从而有利于病理性压力下的细胞存活。我们先前的结果表明，基因敲除Mst-1对脊髓损伤后的脊髓运动神经元具有保护作用，那么这种神经保护作用的机制是否是由于自噬流增强造成的，尚不十分清楚。因此，我们通过检测自噬相关蛋白的表达变化，探明Mst-1敲除后的自噬流的变化情况，探讨Mst-1敲除促进脊髓损伤后的神经元保护作用机制。
　　方法：
　　1.利用蛋白免疫印迹的方法检测损伤后1天到4周的野生型和Mst-1-/-小鼠损伤部位的LC3-II表达谱。
　　2.选取LC3-II表达高峰7天的时间点，利用蛋白免疫印迹的方法分别检测损伤后7天LC3-II以及p62的表达。确定损伤后7天的自噬流情况。
　　3.利用免疫荧光的方法检测损伤后7天脊髓运动神经元中自噬相关蛋白LC3-II和p62的表达变化。
　　4.使用自噬流抑制剂巴弗洛霉素阻断自噬流后，利用免疫荧光的方法检测ChAT阳性的运动神经元数量变化，明确Mst-1敲除引起的运动神经元保护作用与自噬流是否相关。
　　5.利用蛋白免疫印迹的方法检测巴弗洛霉素阻断自噬流后，自噬相关蛋白LC3-II和p62的表达，确定自噬流的变化情况。
　　6.利用免疫荧光的方法检测巴弗洛霉素阻断自噬流后，运动神经元中自噬相关蛋白LC3-II和p62的表达，确定自噬流的变化情况。
　　结果:
　　1.蛋白免疫印迹的结果显示，损伤后1天到4周，Mst-1+/+与Mst-1-/-小鼠损伤部位的LC3-II的表达均上调，并且这种上调的趋势在损伤后7天达到高峰，而后逐渐下降；而在相同的时间点，Mst-1-/-比Mst-1+/+组损伤部位的LC3-II表达更高。
　　2.蛋白免疫印迹的结果显示，损伤后7天，Mst-1-/-比Mst-1+/+组LC3-II的表达更高，而p62的表达更低。说明Mst-1-/-组自噬体形成更多，而溶酶体降解途径更强。Mst-1-/-组的自噬流增强。
　　3.免疫荧光的结果显示，损伤后7天，Mst-1-/-比Mst-1+/+组运动神经元中LC3-II的表达更高，而p62的表达更低。说明Mst-1-/-组运动神经元中自噬体形成更多，而溶酶体降解更强。Mst-1-/-组运动神经元中自噬流增强。
　　4.免疫荧光的结果显示，巴弗洛霉素（Bafilomycin A1,Baf）阻断自噬流后，Mst-1+/+与Mst-1-/-组ChAT阳性的运动神经元数量均减少，而Mst-1+/+组运动神经元减少比Mst-1-/-组更多。说明自噬流对于脊髓损伤后的运动神经元保护是必要的，而Mst-1-/-减少Baf处理导致的运动神经元死亡。
　　5.蛋白免疫印迹的结果显示，Baf阻断自噬流后，Mst-1+/+与Mst-1-/-组损伤部位的LC3-II和p62的表达均上调，说明Baf成功地阻断了自噬流。另外，Mst-1-/-比Mst-1+/+组的p62水平更低，说明Mst-1-/-可以在一定程度上改善Baf处理导致的溶酶体降解途径的抑制作用。
　　6.免疫荧光的结果显示，Baf阻断自噬流后，Mst-1+/+与Mst-1-/-组损伤部位运动神经元中的LC3-II和p62的表达均上调，说明Baf成功地阻断了自噬流。另外，Mst-1-/-比Mst-1+/+组运动神经元中p62的水平更低，说明Mst-1-/-可以在一定程度上改善Baf处理导致的溶酶体降解途径的抑制作用。
　　结论：这些结果表明，脊髓损伤后，损伤部位的自噬被激活，并且自噬流发生紊乱；而基因敲除Mst-1可以通过更多的自噬体形成，更强的自噬-溶酶体降解途径，在一定程度上改善这种自噬紊乱的状态；而损伤早期充分降解由脊髓损伤造成的有毒有害的蛋白聚集，可能是Mst-1敲除促进运动神经元存活的原因之一；Baf阻断自噬流的实验说明，脊髓损伤后，提高自噬流对基因敲除Mst-1促进脊髓运动神经元的存活是必要的。

目录

引言

材料与方法

1.1 实验动物

1.2 仪器设备

1.3 实验试剂

1.3.1 主要试剂来源

1.3.2 主要试剂配制

1.3.3 抗体

1.4 实验方法

1.4.1 建立小鼠脊髓T9全横断模型

1.4.2蛋白免疫印迹实验（western blot）

1.4.3 免疫组织化学切片的制备

1.4.4 行为学检测后肢运动功能恢复情况

1.4.5 明胶包片

1.4.6 荧光金（FG，Fluorogold）标记脊髓运动神经元

1.4.7 数据分析方法

第一部分：脊髓损伤后Mst-1敲除提高自噬流保护脊髓运动神经元的作用研究

实验结果

2.1脊髓损伤诱导Mst-1表达

2.2 基因敲除Mst-1促进脊髓损伤后运动神经元存活

2.3 基因敲除Mst-1促进损伤后小鼠突触重建及运动功能恢复

讨论

综述：Hippo/Mst-1信号通路与神经系统疾病研究进展

第二部分：脊髓损伤后Mst-1敲除提高自噬流保护脊髓运动神经元的机制研究

实验结果

3.1 基因敲除Mst-1提高脊髓损伤后自噬流水平

3.2 基因敲除Mst-1提高脊髓运动神经元自噬流水平

3.3 Mst-1敲除的神经保护作用是通过提高自噬流水平完成的

讨论

综述：自噬在脊髓损伤中的作用和机制

结论

参考文献

攻读学位期间本人发表及待发表的论文

本课题所受基金资助

缩略词表

致谢