非小细胞肺癌中TIF1γ的调控机制及其与TGF-β诱导的上皮-间质转化关系的研究

摘要

背景与目的：肺癌已成为全球最为常见的肿瘤之一（全球发病率占所有肿瘤的13.5％，2016），由其导致的死亡率更是位居全球之首（26.5%，2016）。其中，非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）患者占全部肺癌患者的85%以上。转移是引起肿瘤（包括NSCLC）患者死亡的主要原因，约90%的肿瘤患者的死亡是由肿瘤的转移引起的。上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）是癌症转移过程中上皮细胞获得转移能力的重要事件。在多种癌症中，transforming growth factor(TGF)-β信号通路被证实可诱导细胞发生EMT。TIF1γ(Transcription intermediary factor1 gamma)是近年来发现的一种新的TGF-β信号通路调控因子。TIF1γ的表达下调或者缺失可促进多种肿瘤的发生，并且在乳腺上皮细胞中，TIF1γ的表达缺失可促进TGF-β诱导的EMT。我们前期的实验结果证实与癌旁组织相比，TIF1γ在NSCLC患者中表达下调。然而在NSCLC中TIF1γ能否促进TGF-β诱导的EMT，以及TIF1γ表达下调是受何种机制调控的我们还不清楚。本研究旨在探讨NSCLC中TIF1γ在TGF-β诱导的EMT中的作用，阐明TIF1γ在NSCLC中的下调机制，为NSCLC的发病机制提供新的思路和实验依据。
　　方法：
　　第一部分、非小细胞肺癌中SOX2抑制TIF1γ的表达从而促进了TGF-β诱导的上皮间质转化
　　（1）构建含有TIF1γ基因不同启动子区段的重组质粒并转染A549细胞，鉴定 TIF1γ基因启动子区活性。
　　（2）凝胶迁移实验（EMSA）和染色质免疫共沉淀（CHIP）实验研究SOX2与TIF1γ基因启动子区的结合。
　　（3）利用慢病毒载体构建SOX2过表达以及TIF1γ沉默的稳转NSCLC细胞株。
　　（4）构建含有PAI-1基因启动子区的荧光素酶报告载体，检测SOX2过表达以及TIF1γ干扰对TGF-β诱导的PAI-1基因启动子活性的影响。
　　（5）实时定量荧光PCR和Western blot检测TIF1γ、SOX2以及其他蛋白的表达。
　　（6）利用Transwell细胞迁移侵袭实验以及裸鼠转移模型构建来检测体外与体内细胞侵袭与转移能力的变化。
　　（7）免疫荧光实验检测 TIF1γ干扰后，A549细胞中SMAD3和SMAD4蛋白的变化。
　　第二部分、非小细胞肺癌中环状RNA circPTK2通过调控TIF1γ的表达从而影响TGF-β诱导的上皮间质转化
　　（1）实时定量荧光PCR，免疫组化以及Western blot检测circPTK2、miR-429和TIF1γ以及其他蛋白的表达。
　　（2）双荧光报告载体技术检测miR-429与 TIF1γ基因3’UTR以及circPTK2预测位点的靶向作用关系。
　　（3）利用Transwell细胞迁移侵袭实验来检测细胞侵袭能力的变化。
　　（4）利用慢病毒载体构建稳定过表达circPTK2的A49细胞株。
　　（5）瞬时转染miR-429 mimics和anti-miR-429 mimics构建miR-429过表达以及干扰的A549细胞株。
　　（6）非小细胞肺癌组织里circPTK2与TIF1γ表达相关性分析。
　　结果：
　　第一部分、非小细胞肺癌中SOX2抑制TIF1γ的表达从而促进了TGF-β诱导的上皮间质转化
　　(1)TIF1γ基因启动子区存在SRY相关蛋白结合位点，并可转录抑制TIF1γ基因的表达；
　　(2)SOX2可被募集结合到TIF1γ基因启动子上，并可负向调控TIF1γ基因启动子活性和TIF1γ的表达；
　　(3)在NSCLC组织里，TIF1γmRNA表达下调，并且与SOX2表达呈负相关；
　　(4)干扰TIF1γ可促进TGF-β诱导的NSCLC细胞EMT和迁移与侵袭以及体内NSCLC细胞的转移；
　　(5)过表达SOX2可促进TGF-β诱导的NSCLC细胞EMT和迁移与侵袭；
　　(6)干扰SOX2表达可抑制TGF-β诱导的NSCLC细胞EMT和迁移与侵袭；
　　(7)干扰TIF1γ和过表达SOX2均可促进SMAD4依赖的PAI-1启动子活性。
　　第二部分、非小细胞肺癌中环状RNA circPTK2通过调控TIF1γ的表达从而影响TGF-β诱导的上皮间质转化
　　（1）NSCLC组织里，TIF1γ表达下调且TIF1γ高表达可提高NSCLC患者生存率。
　　（2）在TGF-β1诱导A549细胞EMT过程中，环状RNA circPTK2表达下调。
　　（3）miR-429靶向抑制TIF1γ表达促进TGF-β诱导的NSCLC细胞的EMT以及转移与侵袭。
　　（4）A549细胞中circPTK2可吸附miR-429并调节TIF1γ的表达。
　　（5）过表达circPTK2可抑制TGF-β诱导的NSCLC细胞的EMT以及转移与侵袭。
　　（6）CircPTK2在NSCLC组织中低表达且与TIF1γ表达呈正相关。
　　结论：我们的第一部分研究揭示了转录因子SOX2通过负向调控转录中介因子TIF1γ进而促进TGF-β诱导NSCLC上皮-间质转化（EMT）的新机制。同时提示TIF1γ与TGF-β信号通路中的SMAD4蛋白竞争结合p-SMAD3发挥其抑制EMT的功能。第二部分研究揭示在NSCLC中环状RNA circPTK2可通过吸附miR-429调控TIF1γ的表达，从而促进TGF-β诱导NSCLC上皮-间质转化（EMT）。此部分研究揭示了NSCLC中另一个调控TIF1γ表达的新机制。上述两项研究为通过调控TGF-β信号通路而干预NSCLC的侵袭转移提供了重要思路。

目录

声明

一、引言

二、实验材料与方法

（一）实验材料

（二）实验方法

三、实验结果

第一部分 非小细胞肺癌中SOX2抑制TIF1γ的表达从而促进了TGF-β诱导的上皮间质转化

第二部分 非小细胞肺癌中环状RNA circPTK2通过调控TIF1γ的表达从而影响TGF-β诱导的上皮间质转化

四、讨论

第一部分 非小细胞肺癌中SOX2抑制TIF1γ的表达从而促进了TGF-β诱导的上皮间质转化

第二部分 非小细胞肺癌中环状RNA circPTK2通过调控TIF1γ的表达从而影响TGF-β诱导的上皮间质转化

全文总结

参考文献

综述:环状RNA与肿瘤发生与发展关系的研究

攻读博士期间发表论文

附录：缩略词表及注释

本论文中课题受以下基金资助

致谢