Hedgehog信号通路在TGF-β1诱导非小细胞肺癌上皮间质转化中的作用及机制研究

摘要

目的:探讨阻断Hedgehog信号通路对转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）诱导非小细胞肺癌(Non-smallcell lung cancer, NSCLC)上皮间质转化(Epithelial-MesenchymalTransition， EMT)的影响。
　　方法:
　　1、采用TGF-β1(1、5和10ng/ml)诱导肺腺癌A549细胞48h，倒置显微镜观察A549细胞株形态学变化，荧光定量PCR检测Gli1 mRNA的表达水平，Western blotting检测Gli1、Vimentin和E-cadherin的表达水平，细胞免疫荧光方法检测Gli1蛋白表达量的变化。划痕实验检测A549细胞株迁徙能力的变化。
　　2、采用5ng/ml TGF-β1诱导非小细胞肺癌H460和SK-MES-1细胞48h，荧光定量PCR检测两种细胞中Gli1 mRNA的表达水平，Westernblotting检测Gli1、E-cadher和Vimentin的表达水平，Transwell小室侵袭实验检测侵袭能力的变化。
　　3、分别采用Cyclopamine和GANT61特异性阻断A549细胞Hedgehog信号通路中的信号转导因子Smoothened(Smo)及Humanglioma-associated oncogene homolog1(Gli1)，24h后，加入终浓度为5ng/ml的TGF-β1诱导48h，荧光定量PCR检测Gli1 mRNA的表达水平，Western blotting检测Gli1、Vimentin和E-cadherin的表达水平，细胞免疫荧光方法检测Vimentin和E-cadherin蛋白表达量的变化。Transwell小室侵袭实验检测侵袭能力的变化。
　　4、以Gli1 siRNA转染A549细胞，8h后，加入5ng/ml的TGF-β1诱导48h，荧光定量PCR检测Gli1 mRNA的表达水平，Western blotting及细胞免疫荧光方法检测Gli1、Vimentin和E-cadherin的表达水平，Transwell小室侵袭和迁移实验检测侵袭及迁移能力的变化。
　　5、采用GANT61特异性阻断H460和SK-MES-1细胞Gli1，24h后，加入5ng/ml的TGF-β1诱导48h，荧光定量PCR检测Gli1 mRNA的表达水平，Western blotting检测Gli1、E-cadherin和Vimentin的表达水平，Transwell小室侵袭实验检测侵袭能力的变化。
　　结果:
　　1、倒置显微镜下观察经TGF-β1诱导48h后的A549细胞形态发生了明显的改变，Western blotting检测显示随着TGF-β1药物浓度的升高，各组NSCLC细胞中上皮细胞标志物E-cadherin表达明显减弱，而间质细胞标志物Vimentin表达明显上升。细胞划痕实验检测结果显示TGF-β1诱导后A549细胞迁移能力增强，Transwell小室侵袭实验检测结果显示TGF-β1诱导后H460和SK-MES-1细胞株侵袭能力增加。
　　2、荧光定量PCR和Western blotting检测结果均表明在TGF-β1诱导NSCLC发生EMT的过程中皆伴随着Hedgehog信号通路下游效应因子Gli1 mRNA及蛋白的高表达，细胞免疫荧光检测也证实了相同的结果。
　　3、通过siRNA和药物Cyclopamine及GANT61特异性阻断NSCLC细胞Smo及Gli124h后，各组分别加入终质量浓度为5ng/mL的TGF-β1进行诱导。荧光定量PCR、Western blotting或细胞免疫荧光检测结果显示siRNA和药物均显著抑制Gli1 mRNA及蛋白的表达。Western blotting检测结果显示，siRNA和药物干预后的NSCLC细胞中Vimentin蛋白表达明显减弱，而上皮细胞标记蛋白E-cadherin表达明显增多，细胞免疫荧光检测显示了相同的结果。Transwell小室侵袭和迁移实验结果显示，siRNA和药物干预后的NSCLC细胞株侵袭和迁移的能力明显下降。
　　结论:特异性阻断Hedgehog信号通路可以抑制TGF-β1诱导NSCLC细胞EMT的产生，提示Hedgehog信号通路在NSCLC细胞EMT的产生中起重要作用。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 实验方法

2 实验结果

2．1 TGF-β1可诱导NSCLC细胞发生EMT

2．2 TGF-β1诱导NSCLC细胞中Gli1呈高表达

2．3 siRNA和药物干预下调TGF-β1诱导NSCLC细胞中Gli1的表达

2．4 siRNA和药物干预显著抑制TGF-β1诱导NSCLC细胞发生EMT

2．5 siRNA和药物干预显著抑制TGF-β1诱导NSCLC细胞的侵袭能力

讨论

全文总结

参考文献

文献综述 Hedgehog信号通路与肿瘤的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文