MiR-367-3p抑制TGF-β诱导的非小细胞肺癌上皮-间质转化的作用机制

摘要

目的：目前来看肺癌仍是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。调查数据显示肺癌约占男性癌症死亡率的28％及女性的26%，均居癌症相关死亡率的首位。肺癌中又以非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)最为多见，约占肺癌总数的85%。虽然近年来靶向治疗的发展在一定程度上提高了非小细胞肺癌的治疗效果，但五年生存率仍无明显改善。影响NSCLC预后的最主要因素是复发和转移，研究表明 TGF-β在癌症早期能抑制上皮细胞增殖起着抑癌作用，而在晚期则促进肿瘤生长和转移；体内 TGF-β含量较高的患者预后较差。因此对NSCLC侵袭、转移机制的研究已成为当前国内外研究的热点。MicroRNA发挥基因表达调控作用通常是通过与特定的靶基因3'UTR种子序列完全或不完全互补配对来实现基因沉默或降解的。已经有许多研究表明在各种癌症的发生和发展过程中检测到了多种microRNAs表达的改变。我们通过生物信息学网站预测显示多个microRNAs可以靶向ZEB2的3'UTR区域的不同种子序列。本研究旨在探讨NSCLC中ZEB2异常表达的microRNA调控机制，为NSCLC的早期诊断和治疗提供实验依据。
　　方法：⑴生物信息学软件预测分析能够靶向 ZEB2的3'UTR区域的microRNAs，我们筛选到 miR-367-3p。首先运用双荧光素酶活性检测实验验证miR-367-3p是否与ZEB23'UTR区域的种子序列直接结合，验证miR-367-3p对ZEB2的靶向作用。合成miR-367-3p mimics瞬时转染A549和H226细胞，运用Real-Time PCR和Western Blot方法检测转染前后ZEB2 mRNA和蛋白表达变化。⑵Real-Time PCR方法分别检测在人正常支气管细胞HBE和6株NSCLC细胞以及20例淋巴结转移、20例没有淋巴结转移和60对 NSCLC组织样本中miR-367-3p和ZEB2基因的mRNA表达水平。并且将20例淋巴结转移、20例没有淋巴结转移的NSCLC组织中miR-367-3p和ZEB2基因做差异性表达对比分析，将60对NSCLC样本组织中的miR-367-3p和ZEB2基因的表达作回归分析，统计出 NSCLC中 ZEB2和 miR-367-3p表达的相关性。⑶将miR-367-3p的模拟体mimics转染至NSCLC细胞株A549和H226中，在加或不加TGF-β刺激下，运用Western Blot方法检测TGF-β诱导的EMT分子marker：E-cadherin,N-cadherin,Vimentin的蛋白表达情况。运用Transwell细胞迁移和侵袭实验检测细胞迁移及侵袭能力的变化。⑷将si-ZEB2转染到 NSCLC细胞株A549和H226细胞中将ZEB2基因干扰，在加或不加TGF-β刺激下，运用Western Blot方法检测TGF-β诱导的EMT分子marker：E-cadherin,N-cadherin,Vimentin的蛋白表达情况。运用Transwell细胞迁移和侵袭实验检测细胞迁移及侵袭能力的变化。
　　结果：①通过生物信息学软件预测和在NSCLC细胞中的Dual Luciferase Reporter Assay实验可知miR-367-3p可以结合在ZEB2基因的3'UTR区。NSCLC细胞株A549和H226瞬时转染miR-367-3p模拟体mimics，ZEB2基因的mRNA和蛋白表达都显著下降。因此可证明miR-367-3p下调ZEB2基因的mRNA和蛋白表达并且这种作用是通过miR-367-3p与ZEB2基因的3'UTR种子序列直接结合引起的。②与正常肺上皮细胞HBE相比NSCLC细胞A549、95C、95D、H1299、H226、和LTEP-α-2中ZEB2 mRNA高表达，miR-367-3p低表达。相比于20例没有淋巴结转移的 NSCLC组织，在20例有远端淋巴结转移的 NSCLC组织中，ZEB2基因明显高表达但是 miR-367-3p的表达没有体现出差异性表达。在60对NSCLC组织样本中，我们通过癌组织比癌旁组织对ZEB2和miR-367-3p的表达作回归分析发现NSCLC中两者的表达之间是没有明显相关性的。③在NSCLC细胞A549和H226中瞬转miR-367-3p mimics过表达后，在加或不加TGF-β刺激下，由 TGF-β诱导的 EMT分子 marker中，E-cadherin蛋白表达上调、N-cadherin、Vimentin蛋白表达下调。并且Transwell实验显示miR-367-3p mimics过表达后A549和H226细胞的转移与侵袭能力受到抑制。④在NSCLC细胞A549和H226中干扰ZEB2后，在加或不加TGF-β刺激下，由TGF-β诱导的EMT分子marker中，E-cadherin蛋白表达上调、N-cadherin、Vimentin蛋白表达下调。并且Transwell实验显示干扰ZEB2基因后A549和H226细胞的转移与侵袭能力受到抑制。
　　结论：NSCLC中miR-367-3p能够直接靶向ZEB2的3'UTR种子序列而沉默ZEB2基因的表达。相比于HBE细胞，NSCLC细胞中miR-367-3p低表达而ZEB2基因高表达。NSCLC患者组织中有淋巴结转移的NSCLC组织样本中ZEB2基因表达明显高于没有淋巴结转移的NSCLC组织样本，但是 miR-367-3p没有在两者之间体现差异性表达。进一步验证 miR-367-3p和 ZEB2在NSCLC组织中表达的相关性发现两者并没有呈现出负相关性，可能原因第一是由于miR-367-3p的表达量在NSCLC组织中太低，还有就是可能其他miRNA或LncRNA也参与了对ZEB2和miR-367-3p的调控作用。但是，miR-367-3p可能是一种抑癌基因，在肺癌的发生于发展中，miR-367-3p参与调节TGF-β诱导的EMT过程中上游转录因子ZEB2的表达，在抑制TGF-β诱导的NSCLC细胞上皮-间质转化过程中发挥重要作用。通过研究 miR-367-3p对 ZEB2基因的抑制作用可能会有助于提高我们对 NSCLC的致病机制的了解，进而对NSCLC的诊断和治疗提供可靠的理论基础。

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一、前言

二、材料与方法

2.1材料

2.1.1细胞株与组织样本

2.1.2实验用仪器和试剂

2.1.3常用溶液的配制1、磷酸盐缓冲液PBS NaCl

2.2方法

2.2.1生物信息学方法

2.2.2细胞培养

2.2.3细胞和组织中总RNA的提取

2.2.4实时荧光定量PCR（SYBR染料法）

2.2.5细胞裂解和总蛋白的提取

2.2.6 Western blot

2.2.7 microRNA mimics/siRNA瞬时转染细胞

2.2.8重组质粒的构建

2.2.9重组质粒和microRNA瞬时共转染细胞以及荧光素酶报告实验

2.2.10细胞迁移与侵袭能力Transwell试验

2.2.11统计方法与分析结果

三、结果

3.1 NSCLC细胞中，ZEB2与miR-367-3p的靶向作用关系

3.1.1 查阅文献和生物信息学软件分析预测

3.1.2 双荧光素酶报告基因活性检测结果证明 miR-367-3p 可以直接与 ZEB2基因3’UTR种子序列互补结合

3.1.3 miR-367-3p对A549和H226细胞内源性ZEB2基因的调控

3.2 不同NSCLC细胞株和HBE中ZEB2与miR-367-3p的表达水平检测

3.3 NSCLC组织中miR-367-3p和ZEB2基因的mRNA表达水平以及其相关关系验证

3.3.1 NSCLC患者组织样本中有远端淋巴结转移和没有淋巴结转移的非小细胞肺癌组织样本种miR-367-3p的差异性表达

3.3.2 NSCLC患者组织样本中有远端淋巴结转移和没有淋巴结转移的非小细胞肺癌组织样本之间的ZEB2基因mRNA的差异性表达

3.3.3 NSCLC组织中miR-367-3p和ZEB2 的mRNA表达相关性验证

3.4 NSCLC细胞中miR-367-3p抑制TGF-β诱导的上皮-间质转化（EMT）

3.5 NSCLC细胞中 miR-367-3p对其 TGF-β诱导的细胞 EMT 表型迁移与浸润的抑制

3.6 NSCLC细胞中，ZEB2基因对其迁移与浸润作用影响

3.6.1 NSCLC细胞中，si-ZEB2干扰ZEB2基因的mRNA 和蛋白的表达

3.6.2 NSCLC细胞中si-ZEB2抑制TGF-β诱导的上皮-间质转化（EMT）

3.6.3 NSCLC细胞中，干扰ZEB2基因抑制细胞的迁移与浸润的表型研究

四、全文总结

五、全文讨论

参考文献

附录：中英文对照

攻读硕士学位期间公开发表的学术论文

致谢