间充质干细胞旁分泌效应对肾缺血再灌注损伤的保护作用

摘要

目的：观察输注骨髓间充质干细胞条件培养基（mesenchymal stem cells derived conditioned medium, MSC-CM）对小鼠肾脏缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury, IRI）的保护作用及其机制。
　　方法：分离培养纯化C57小鼠骨髓MSC，观察其形态，流式细胞仪检测细胞表面标记，检测其成骨、成脂和成软骨能力；以夹闭双侧肾蒂30min的方法制备小鼠双肾IRI模型，实验组于恢复肾血流3h后经腹腔注射MSC-CM500ul，并设缺血对照组、假手术组和成纤维细胞上清对照组；检测术后各时间点和各组的血肌酐和尿素氮水平；对术后24h的肾组织病理改变和肾小管上皮细胞凋亡情况进行观察；Western Blot法检测术后24h肾组织中凋亡相关蛋白水平的表达；细胞因子芯片检测术后24h各组小鼠血清及MSC和成纤维细胞上清中细胞因子含量差异。同时建立小鼠肾小管上皮细胞体外缺氧/复氧模型，实验组于复氧后加入MSC-CM共培养，并设缺氧对照组和正常细胞组。
　　结果：缺血再灌注术后24h肾损伤程度最重，此时输注MSC-CM组的肾功能较对照组明显好转、肾脏病理损伤减轻，细胞凋亡数减少（P<0.05）。Western blot显示缺血组小鼠肾组织中三种凋亡蛋白水平较假手术组上升，而MSC-CM干预后上述蛋白水平明显下降（P<0.05）。细胞因子芯片显示多种炎性趋化及黏附因子在缺血组显著增高，而在 MSC-CM组明显降低（P<0.05）,有三种细胞因子在 MSC-CM中的含量明显多于成纤维细胞上清。体外模型亦证实MSC-CM干预能够显著降低缺氧/复氧引起的细胞凋亡。
　　结论：输注MSC-CM可明显减轻缺血再灌注诱导的小鼠肾损害，可能是通过减轻炎症反应和抑制肾小管细胞凋亡发挥作用，具体分子机制还有待进一步研究。

目录

声明

第一章 序 言

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 实验试剂

2.1.3 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞（BM-MSC）分离培养

2.2.2小鼠骨髓间充质干细胞（BM-MSC）表型鉴定

2.2.3小鼠骨髓间充质干细胞（BM-MSC）成脂诱导

2.2.4小鼠骨髓间充质干细胞（BM-MSC）成骨诱导

2.2.5小鼠骨髓间充质干细胞（BM-MSC）成软骨诱导

2.2.6 小鼠骨髓间充质干细胞条件培养基（MSC-CM）的制备

2.2.7 小鼠皮肤成纤维细胞上清的制备

2.2.8实验动物分组与模型建立

2.2.9小鼠肾功能检查

2.2.10肾组织病理改变的观察

2.2.11细胞凋亡的检测：

2.2.12 Western Blot 法检测 Cytochrome C、Cleaved Caspase-9 和 Cleaved Caspase-3蛋白水平的表达

2.2.13小鼠血清细胞因子分析

2.2.14 小鼠MSC浓缩上清、未浓缩上清与小鼠皮肤成纤维细胞上清中的细胞因子分析

2.2.15体外实验：

2.3 统计学方法

第三章 实验结果

3.1小鼠BM-MSC培养及鉴定

3.2 小鼠肾缺血再灌注损伤模型的建立

3.2小鼠肾功能水平

3.3肾小管损伤评分

3.4 肾小管上皮细胞凋亡情况

3.5 凋亡相关蛋白的表达水平

3.6 小鼠血清细胞因子芯片结果

3.7小鼠MSC与成纤维细胞上清细胞因子芯片结果及体内验证

3.8 MSC体外干预细胞凋亡状况

第四章 讨 论

第五章 结 论

参考文献

文献综述:间充质干细胞在肾移植领域的研究进展

缩写词表

攻读学位期间公开发表论文

致谢