脯氨酸羟化酶Ⅱ对脂肪间充质干细胞旁分泌介导的心肌保护作用的影响及其机制研究

摘要

目的：观察RNA干扰脂肪间充质干细胞脯氨酸羟化酶II(PHD2)对其旁分泌介导的心肌保护作用的影响及其机制。
　　方法：本实验原代提取人脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSCs)，并采用流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测表面分子进行鉴定。包装脯氨酸羟化酶II(PHD2) RNA干扰载体的慢病毒转染ADSCs使其PHD2低表达。用H2O2(100μM)刺激新生大鼠心肌细胞(neonatal rat ventricular myocytes, NRVMs)6小时，建立心肌细胞氧化损伤模型。实验将NRVMs分为5组：正常对照组，H2O2氧化损伤模型组，ADSC-条件培养基（conditioned medium, CM）组，空载体-ADSC-CM组，PHD2干扰-ADSC-CM组，其中后四组均用H2O2处理。ADSC条件培养液(CM)预处理NRVMs，采用末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记(TUNEL)染色和免疫印迹法检测caspase-3蛋白表达观察H2O2诱导的心肌细胞凋亡。ELISA方法检测ADSC-CM中的促存活细胞因子血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、肝细胞生长因子-1(hepatocyte growth factor, HGF)、间质细胞衍生因子1(stromal-derived factor1, SDF-1)、胰岛素样生长因子-1(insulin growth factor-1, IGF-1)和分泌型卷曲相关蛋白2(secreted frizzled-related protein2, sFRP2)。
　　结果：1.采用流式细胞术检测ADSCs细胞表面分子，其中CD44，CD73，CD90，CD105表达均为阳性，表达阳性细胞比例分别为CD4496.07％，CD7399.81%，CD9099.22%， C10599.91%；CD34，CD45表达阳性细胞比例分别为0.96%和0.15%，表达几乎为阴性。流式细胞仪检测结果显示细胞均一性较好，表型表达与既往研究报道结果一致，因此基本可以断定本实验所分离、培养出的细胞主要为ADSCs，且纯度较高。
　　2. ADSCs采用第3代，待融合度达50～60%，进行空载体Lenti-GFP和Lenti-shPHD2-GFP慢病毒转染，感染效率（绿色荧光阳性率）达90%以上。
　　3.空载体-GFP和PHD2干扰慢病毒载体转染ADSCs成功后，免疫印迹法检测ADSCs的PHD2的蛋白表达，PHD2干扰-ADSC组较空载体-GFP组降低约70%(P<0.05)。
　　4. H2O2处理导致心肌细胞明显凋亡，TUNEL染色检测细胞凋亡比率为（71.7±0.9）%。在ADSC-CM组、空载体-ADSC-CM组，其条件培养液预处理在一定程度上均减弱H2O2诱导的心肌细胞凋亡，较H2O2氧化损伤模型组TUNEL阳性率分别降低12.9%和16.9%。PHD2干扰-ADSC-CM较空载体-ADSC-CM预处理明显减少NRVM的凋亡，TUNEL阳性率降低30.3%(P<0.05)。
　　5. H2O2处理导致心肌细胞明显凋亡，caspase-3蛋白表达较对照组升高64.2%。在ADSC-CM组、空载体-ADSC-CM组，其条件培养液预处理在一定程度上均减弱 H2O2诱导的心肌细胞凋亡，较H2O2氧化损伤模型组caspase-3蛋白表达分别降低16.5%和24.1%。PHD2干扰-ADSC-CM较空载体-ADSC-CM预处理明显减少NRVM的凋亡，caspase-3蛋白表达降低24.8%(P<0.05)。
　　6. PHD2干扰后ADSC-CM中细胞因子IGF-1和sFRP2明显增加，分别为空载体-ADSC-CM的2.09倍（P<0.05）和1.76倍（P<0.05）。IGF-1中和抗体干预后，与PHD2干扰-ADSC-CM组相比，PHD2干扰-ADSC-CM-IGF-1抗体中和组TUNEL阳性率明显升高(P<0.05)；sFRP2中和抗体干预后，与PHD2干扰-ADSC-CM组相比，PHD2干扰-ADSC-CM-IGF-1抗体中和组caspase-3蛋白表达明显升高(P<0.05)。说明IGF-1和sFRP2中和抗体干预后PHD2干扰-ADSC-CM的的抗心肌细胞凋亡作用明显受抑制。
　　结论：1. ADSC通过旁分泌作用抑制超氧应激诱导的心肌细胞损伤。2. PHD2干扰后增强了ADSC旁分泌介导的心肌保护作用，其机制可能为增加ADSC促存活细胞因子IGF-1和sFRP2的分泌。

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第一章 前言

第二章 实验材料

2.1 主要仪器

2.2 主要材料与试剂

2.3 主要试剂的配制

第三章 实验方法

3.1 细胞培养和鉴定

3.2 人脂肪间充质干细胞（hADSCs）慢病毒转染及条件培养基收集

3.3 NRVM体外氧化损伤模型的建立

3.4 免疫印迹法检测PHD2和caspase-3蛋白表达水平

3.5 TUNEL染色检测NRVM凋亡

3.6 细胞因子检测方法（ELISA试剂盒）

3.7 实验路线图（细胞试验）

2.8 统计学处理

第四章 结果

4.1 细胞培养及鉴定

4.2 H2O2诱导NRVM氧化损伤模型

4.3 慢病毒感染ADSCs及感染效率的测定

4.4 PHD2干扰后ADSCs条件培养液预处理NRVM凋亡的变化

4.5 ADSCs条件培养液中旁分泌细胞因子检测及其阻断试验

第五章 讨论

第六章 结论

参考文献

文献综述

1 干细胞及其分类

2 移植途径及存活

3 移植干细胞存活率低的原因

4 目前针对干细胞移植存活问题的解决途径

5 结语

参考文献

附录一 个人简历

附录二 发表论文的情况

致谢