miR-133b修饰的MSCs来源外泌体对大鼠脑出血后的神经保护及机制的实验研究

摘要

目的：
　　实验1：研究Sprague-Dawley（SD）大鼠脑出血（ICH）血肿周围脑组织中microRNA-133b(miR-133b)在ICH后不同时间点的变化。
　　实验2：收集miR-133b修饰的骨髓间充质干细胞（MSCs）分离充足含有miR-133b的外泌体。
　　实验3：研究外泌体作为载体将miR-133b传递到神经细胞中的方式对于ICH后脑损伤的神经保护作用，以及探讨此神经保护的可能机制。
　　方法：
　　实验1：选48只大鼠（一共使用50只，其中48只存活）随机分为假手术（sham）组和ICH后12h、24h、48h、72h、96h、120h、168h共8组，每组6只。全部大鼠在ICH后相应时间点均被处死。利用荧光定量PCR检测大鼠血肿周围1.5-2mm范围内脑组织中miR-133b表达水平。
　　实验2：选取6周龄SD大鼠的胫骨和股骨部分分离MSCs，利用全骨髓差异贴壁法纯化MSCs，并培养至第6代的MSCs用于实验，把人工合成的miR-133b mimcs和miR-133b negative control转染MSCs72h，再提取外泌体，用Westenblot鉴定外泌体标志物CD9，CD63，CD81，用荧光定量PCR检测miR-133b表达；
　　实验3：选72只大鼠（一共使用75只，其中72只存活）随机分为sham组，ICH+PBS组（0.5mlPBS，尾静脉注射），ICH+miR-con组（转染miR-con后的100μg外泌体蛋白溶入0.5mlPBS，尾静脉注射5分钟），ICH+miR-133b组（转染miR-133b后的100μg外泌体蛋白溶入0.5mlPBS，尾静脉注射5分钟）。在ICH24h后尾静脉注射PBS，miR-con，miR-133b，ICH后96h所有的大鼠被处死。利用荧光定量PCR检测大鼠血肿周围1.5-2mm范围内脑组织中miR-133b表达水平；每组取6只大鼠脑组织做石蜡切片进行TUNEL染色、Fluoro-Jade B（FJB）染色；每组选取6只大鼠取血肿周围1.5-2mm范围内脑组织，进行Western blot分析。
　　结果：
　　实验1：大鼠ICH后血肿周围脑组织中miR-133b表达下降，以ICH后72h组miR-133b表达下降最为显著（p<0.001）。我们选取ICH后24h作为miR-133b等尾静脉注射的时间点。
　　实验2：在miR-133b mimics转染后的MSCs分泌的外泌体中miR-133b含量较转染miR-con组显著增加（p<0.001）；Western Blot显示外泌体标志蛋白CD9，CD63，CD81在离心后的混悬液中均有表达。
　　实验3：荧光定量PCR显示，ICH+miR-133b组miR-133b表达水平较ICH+miR-con组显著升高（p<0.001）。Westen blot均显示ICH+miR-133b组RhoA表达较ICH+miR-con组显著升高（p<0.01）。TUNEL染色结果为ICH组较sham组神经元凋亡百分比显著增高。与ICH+miR-con组相比，ICH+ miR-133b组血肿周围神经元凋亡程度明显改善（P＜0.01）；FJB染色阳性细胞数在ICH组较sham组明显增多，ICH+miR-133b组FJB阳性细胞数较ICH+miR-con组较明显下降（P＜0.05）；ICH+miR-133b组ERK1/2磷酸化,CREB磷酸化水平均较ICH+miR-con组上升（p<0.01；p<0.05）。
　　结论：
　　miR-133b修饰的MSCs可以分泌充足miR-133b的外泌体；外泌体作为载体可将miR-133b传递给脑组织细胞；miR-133b进而通过靶向RhoA发挥对大鼠ICH后脑损伤的神经保护作用，其机制可能是激活ERK1/2-CREB抗凋亡通路。

目录

前言

参考文献

第一部分 miR-133b在大鼠脑出血后血肿周围脑组织中表达及意义

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 miR-133b修饰的MSCs分泌富含miR-133b的外泌体

材料和方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 miR-133b修饰的MSCs来源外泌体对大鼠脑出血后神经细胞保护作用及其机制的实验研究

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述:miR-133b在中枢神经系统疾病中作用的研究进展

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