虎杖苷对小鼠原位结直肠癌模型小肠的辐射防护和对结直肠癌的放射增敏作用研究

摘要

放射疗法是治疗人类恶性肿瘤最重要的疗法之一，但它对正常组织急性和后期的毒性作用限制了对癌症治疗的效果1。放射性肠道损伤是病人接受腹部或盆腔照射而出现的一个重大临床问题，它限制了盆腔、腹腔及腹膜后恶性肿瘤的放疗效果。小肠是对辐射最敏感的胃肠道器官2。因此寻求有效的小肠辐射防护药成为亟待解决的问题，而辐射防护药除了具有对正常组织的防护作用外，还必须对肿瘤生长没有促进作用。
　　虎杖苷( Polydatin,PD)是从蓼科蓼属虎杖的干燥根茎中提取的第4种单体,是白黎芦醇的一个天然前体。PD已经被广泛的研究，因为它具有巨大的药理学活性，包括抑制炎症介质的产生3，诱导抗氧化剂的产生4，调节免疫功能5，防止突变6，诱导肿瘤细胞的凋亡7，保护肝脏8和预防心血管疾病9。因此，我们推测PD可以作为辐射防护药的候选药物。本文主要研究小鼠原位结直肠癌模型中PD对10Gy腹部照射后小鼠小肠的辐射防护作用，同时探讨PD联合放疗抑制小鼠结直肠癌生长以及在细胞水平上PD对结直肠癌细胞系和Lgr5+肿瘤干细胞（CSCs）的影响。
　　一、PD对小肠的辐射防护作用
　　【目的】：
　　研究PD对小鼠小肠和人肠上皮细胞的辐射防护作用。
　　【方法】：
　　在C57BL/6小鼠中建立氧化偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的原位结直肠癌模型；将原位结直肠癌模型C57BL/6小鼠分为对照组（control组）、PD单给药组（PD组）、单纯照射组（IR组）、PD给药联合照射组（PD+IR组）和氨磷汀给药联合照射组（AMI+IR组）。采用10Gy的X线（200 cGy/min）进行腹部照射，PD的浓度为25mg/kg，于每次放疗前30min腹腔注射给予，放疗每周1次，共进行4次。每组中随机选出5只用于统计小鼠的生存率，另外5只用于取材，第4次放疗结束后一周将取材组小鼠处死，取出小肠组织，然后制备石蜡切片进行HE染色，观察肠道隐窝和绒毛的改变，同时进行免疫组化染色研究Ki67、CD31在肠道的表达情况以及统计小鼠的生存时间。此外，体外培养FHs74Int肠上皮细胞，利用CCK8细胞毒性与增殖实验观察PD对FHs74Int细胞毒性及增殖的影响。同时观察于20Gy腹部照射前后30min腹腔注射不同浓度的PD对C57BL/6小鼠生存时间的影响。
　　【结果】：
　　PD+IR组与IR组相比延长了小鼠小肠的绒毛长度同时增加了小肠隐窝的数量。PD+IR组与IR组相比能够促进小鼠小肠上皮细胞的增殖，增加小肠微血管密度，减轻微血管的凋亡。PD对FHs74Int细胞毒性作用较小，可以促进照射后细胞的增殖。此外，PD能够延长20Gy照射后C57BL/6小鼠的生存时间。
　　【结论】：
　　PD可以减轻照射后小鼠小肠的损伤，促进照射后肠上皮细胞的增殖，增加照射后小肠微血管密度并减少小肠微血管的凋亡，从而对小肠起到辐射防护作用。
　　二、PD辅助结直肠癌放疗的研究
　　【目的】：
　　研究PD在结直肠癌放疗中的作用并探讨其作用机制。
　　【方法】：
　　在C57BL/6小鼠中建立氧化偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的原位结直肠癌模型；将模型鼠分为5组，分别为control组、PD组、IR组、PD+IR组、AMI+IR组，采用10Gy的X线（200 cGy/min）进行腹部照射，PD的浓度为25mg/kg，于每次放疗前30min腹腔注射给予，放疗每周1次，共进行4次；统计各组小鼠结直肠肿瘤的大小及体积分布和肿瘤组织Ki67、cleaved caspase-3的表达情况。体外培养结肠癌细胞系观察PD对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响，同时从CT26结肠癌细胞中分选Lgr5+CSCs，进行培养并观察PD对其增殖和凋亡的影响，并进一步探索PD对其作用的机制。
　　【结果】：
　　在体内实验中，PD+IR组与control组、PD组、IR组、AMI+IR组相比可显著减小肿瘤的体积，PD+IR组与IR组相比更能减少小鼠结直肠肿瘤细胞的增殖和促进其凋亡。在体外实验中，PD+IR组与IR组相比可以抑制结肠癌细胞系的增殖和促进其凋亡，同时还能抑制Lgr5+CSCs的增殖和促进CSCs的凋亡；PD与control组相比能促进HCT116细胞和Lgr5+CSCs的凋亡，同时较高剂量(100μM)的PD与control组相比可显著抑制Lgr5+CSCs的增殖。PD+IR组中加入6.4nM的I型BMP受体抑制剂K02288则会极大地促进Lgr5+CSCs的增殖，显著逆转PD联合照射对Lgr5+CSCs的杀伤作用。
　　【结论】：
　　体内和体外实验中，PD辅助放疗能够减少肿瘤细胞的增殖和促进肿瘤细胞的凋亡，并对Lgr5+CSCs的增殖具有明显的抑制作用。BMP信号通路可能参与了PD的辐射增敏。

目录

声明

引言

第一部分 PD对小肠的辐射防护作用

材料和方法

一、材料

二、实验方法

结果

1、PD可以减轻小鼠小肠辐射后绒毛的损伤和隐窝数量的下降：

2、PD能够促进照射后小鼠小肠隐窝的增殖

3、PD能促进照射后FHs74Int细胞的增殖

4、PD能够增加照射后小鼠小肠微血管密度

5、PD减少照射后小鼠小肠微血管内皮细胞的凋亡

6、PD能延长模型鼠的生存时间

7、PD能延长20Gy照射后C57BL/6小鼠的生存时间

讨论

第二部分 PD辅助结直肠癌放疗的机制研究

材料与方法

一、材料

二、实验方法：

结果

1、PD辅助放疗减小模型鼠肿瘤的体积

2、虎杖苷辅助放疗减少模型鼠结直肠癌细胞的增殖和促进其凋亡

3、PD对不同结直肠癌细胞系增殖的影响

4、PD对结直肠癌细胞凋亡的影响

5、PD对Lgr5+CSCs增殖的影响

6、PD对Lgr5+CSCs凋亡的影响

7、I型BMP受体抑制剂拮抗PD对Lgr5+CSCs增殖的抑制作用

讨论

结论

参考文献

综述: 放射治疗中辐射防护和辐射增敏的新兴靶标

中英文对照缩略词

攻读硕士学位期间公开发表的论文

致谢