蛇床子素对TGF-β1过表达小鼠心肌成纤维细胞中TGF-β1/Smad信号通路的抑制作用研究

摘要

目的：观察蛇床子素对转化生长因子β1(transforming growth factorβ1, TGF-β1)过表达小鼠心肌纤维细胞MCF中TGF-β1/Smad信号通路的作用，并探讨其可能的机制。
　　方法：通过基因重组等技术构建真核表达质粒 pcDNA3.1(+)-TGF-β1，随后利用脂质体转染方法将此重组质粒转染到MCF中，构建TGF-β1过表达MCF细胞模型。实验分为正常细胞对照组， pcDNA3.1(+)-TGF-β1组， pcDNA3.1(+)-TGF-β1+1‰ DMSO组以及pcDNA3.1(+)-TGF-β1+蛇床子素(5，10和20μM)组，共6组。转染24 h后，药物处理组加入不同浓度的蛇床子素后继续孵育24 h，收集细胞，采用实时荧光PCR(Real-time PCR)和Western blot法分别测定α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)，Ⅰ型胶原(collagenⅠ)，Ⅲ型胶原(collagenⅢ)，TGF-β受体Ⅰ(TβRⅠ)，Smad2/3，phospho-Smad2/3(P-Smad2/3)，Smad4和Smad7的mRNA和蛋白表达水平，以及ELISA法测定细胞培养上清中的TGF-β1水平。
　　结果：结果显示，成功构建了真核表达质粒 pcDNA3.1(+)-TGF-β1，并在 MCF上成功建立了TGF-β1过表达的细胞模型。
　　TGF-β1转染后的细胞内α-SMA，collagenⅠ，collagenⅢ，TβRⅠ，P-Smad2/3， Smad2/3和Smad4的表达明显增加(P<0.01)，细胞培养上清中TGF-β1的水平也明显增加(P<0.01)，而细胞内Smad7的表达明显降低(P<0.01)。
　　在给予蛇床子素5，10和20μM处理后，细胞培养上清中TGF-β1的水平以及细胞内α-SMA，collagenⅠ，collagenⅢ，TβRⅠ，P-Smad2/3，Smad2/3和Smad4的表达水平均明显降低(P<0.05或P<0.01)，而细胞内Smad7的表达水平则明显增加(P<0.05或P<0.01)。
　　结论：蛇床子素能够显著降低TGF-β1过表达MCF细胞中的α-SMA，collagenⅠ和 collagenⅢ的表达，具有抗心肌纤维化的作用，其机制可能与抑制 TGF-β1/Smad信号通路有关。

目录

声明

前言

一、研究背景

1 心肌纤维化的概述

2 TGF-β1/Smad信号通路

3 蛇床子素的研究概况

二、课题研究思路

第一部分 TGF-β1过表达小鼠心肌成纤维细胞的制备

1材料与方法

1.1细胞与主要试剂

1.2 主要仪器

1.3 实验动物

1.4 实验方法

1.5 Real-time PCR

1.6 PCR结果分析方法

2.1 目的基因TGF-β1的克隆

2.2重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-TGF-β1的鉴定

2.3不同转染比 (DNA:脂质体)及转染时间对TGF-β1表达的影响

3 小结

第二部分 蛇床子素对TGF-β1过表达小鼠心肌成纤维细胞的影响

第一节 蛇床子素对TGF-β1过表达小鼠心肌成纤维细胞中α-SMA，collagenⅠ和collagenⅢ表达的影响

1 材料与方法

2 实验结果

3 小 结

第二节 蛇床子素对TGF-β1过表达小鼠心肌成纤维细胞中TGF-β1/Smad信号通路的影响

1 材料与方法

2 实验结果

3 小 结

第三部分 讨论

1 TGF-β1过表达细胞模型的建立

2 蛇床子素对TGF-β1过表达MCF中TGF-β1/Smad信号通路的作用

结论

参考文献

综述:心肌纤维化模型制备的现状

缩写词表

攻读硕士学位期间发表的文章

致谢