PBMC中mRNA与DNA甲基化和RA活动度的相关性研究

摘要

类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种病因复杂的慢性、炎症性的自身免疫性疾病。当前研究显示该病是多因素共同导致的结果，遗传对其贡献度接近60％。DNA甲基化作为表观遗传学的重要组成成分，对类风湿性关节炎的发生发展有着重要的调控作用。外周血单个核细胞（Peripheral Blood MononuclearCell，PBMC）由淋巴细胞（T细胞、B细胞、自然杀伤细胞）、单核细胞和树突状细胞等组成，是免疫学研究的重要靶细胞。
　　因此本研究以mRNA为主要靶分子，以PBMC作为靶细胞，从上游的甲基化对mRNA调控模式，以及mRNA与RA活动度的相关性逐步展开。第一部分，以PBMC为靶细胞，以DNA甲基化调控mRNA过程为中心环节，从mRNA与DNA甲基化的表达值与物理位置两个方面出发，探究PBMC中mRNA与DNA甲基化的相关关系并对有意义的相关基因进行生物功能预测，为RA的免疫学机制研究提供线索，同时，也为多水平研究提供数据支持。第二部分以RA为中心，以PBMC为靶细胞，以DAS28为分类参考，通过差异表达分析、韦恩图等方式寻找影响RA发生发展的基因，为RA的机制研究和临床治疗提供新的线索。
　　第一部分
　　目的：
　　以PBMC为靶细胞，以DNA甲基化调控mRNA过程为中心环节，从mRNA与DNA甲基化的表达与物理位置两个方面出发，探究PBMC中DNA甲基化与mRNA的相互关系并对有意义的相关基因进行生物功能预测。
　　材料与方法：
　　用Agilent LncRNA&mRNA microarray芯片和Illumina450K芯片对46个女性的PBMC中的mRNA表达与DNA甲基化水平进行检测，在此基础上，通过四种类型的相关分析和全基因组甲基化-mRNA表达数量性状位点分析(Methylation Site–based mRNA Expression Quantitative Trait Locus，MeS-eQTL)探寻mRNA与 DNA甲基化在表达和地理位置两个方面的关系，并对在相关分析和MeS-eQTL分析中都呈现出显著相关关系的基因进行生物功能分析。
　　结果：
　　单点相关中，19,807个甲基化位点（约6%）与7,968个基因表达值（约60%）呈显著相关（P<0.05），相关系数（rT1）的范围在（-0.63-0.62），正负相关的探针数近似相等。CpG island是低甲基化状态，当逐渐远离CpG island时低甲基化位点逐渐减少，高甲基化位点逐渐增加。复相关分析发现60.1%的基因甲基化与基因表达呈现出显著相关关系（P<0.05），超过10%的基因复相关系数大于0.8。MeS-eQTL分析显示有显著关系（P<0.05）的甲基化位点都聚集在转录起始位点（Transcription Start Site，TSS）附近。生物功能分析发现，在相关分析和MeS-eQTL分析中都呈现出显著相关关系的基因大多都是一些调控细胞和组织重要生物学功能的重要基因。
　　结论：
　　DNA甲基化对mRNA的表达有调控作用，这种调控作用有正有负。大多对mRNA有显著作用的甲基化位点在mRNA转录起始位置。DNA甲基化通过调控mRNA表达影响正常生理活动导致疾病的产生。本研究一方面可以为类风湿性关节炎这类自身免疫性疾病的研究提供有用的线索，另一方面可以丰富我们对两个水平的相关关系的了解，为其他水平的研究提供数据支持。
　　第二部分
　　目的：
　　以疾病活动度评分（disease activity score in28 joints，DAS28）为基础对不同活动度群组的RA病人和健康人群进行分析，挑选出RA活动度相关基因，为疾病的诊断治疗提供新思路与线索。
　　材料与方法：
　　收集28个不同活动度的RA病人和18个健康人的基本信息并用Agilent LncRNA& mRNA microarray芯片对她们PBMC中的mRNA水平进行检测，通过差异表达分析和韦恩图从高活动度的RA病人、低活动度的RA病人、健康人群中挑选出单纯与活动度相关、单纯与发病相关、与活动度和发病都相关的三种基因，并对单纯与活动度相关的基因做相关的生物功能聚类和蛋白质关联分析。
　　结果：
　　挑选出80个单纯与RA活动度相关的基因，36个与RA活动度和发病都有关系的基因。其中，12个单纯与活动度相关的基因（SOCS3、C12orf44、KIFC1、MRPS18A、GYG1、RAB35、B4GALT5、LRRC41、LILRB4、LILRA5、CR1、PDIA6）与DAS28显著相关（P<0.05）且呈趋势性下降，与发病和活动度都相关基因PPIH与DAS28显著相关（P<0.05）且呈趋势性上升。生物功能聚类发现有4项功能和甲基化相关，1项功能和应激反应相关。蛋白质关联分析显示 HIST1H3E、HIST1H4I、HIST1H4F、HIST1H3D和HIST1H3F这5个基因不仅在5个与甲基化相关的功能条目中都有出现而且在实验、文本挖掘和共表达三个方面都存在相互关系。
　　结论：
　　本研究以DAS28为基础挑选出80个单纯与RA活动度相关的基因，36个与RA活动度和发病都有关系的基因。功能分析发现他们大多受到甲基化调控作用，部分功能与免疫应激反应有关。本研究为RA的诊断与治疗提供新的信息，同时也为其他免疫性疾病的研究提供有用线索。

目录

声明

引言

1、类风湿性关节炎

2、外周血单个核细胞

3、DNA甲基化

4、mRNA表达的甲基化相关谱的研究现况

5、RA活动度

6、本研究的研究目的及思路

第一部分：PBMC中mRNA表达与DNA甲基化的相关性研究

一、研究背景

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

五、结论

第二部分：PBMC中mRNA表达与RA活动度的相关性研究

一、研究背景

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

五、结论

参考文献

综述：DNA甲基化与自身免疫性疾病的研究进展

攻读硕士学位期间公开发表的论文

缩写词和中英文对照

附表

致谢