Cbl-b/c-Cbl双敲除树突状细胞在小鼠肝硬化发生发展中的作用及机制研究

摘要

树突状细胞（dendritic cells，DC）是主要的并且是已知的功能最强的抗原递呈细胞（APC），能连接固有免疫和适应性免疫应答。DC广泛分布在机体的各个组织和器官中。在肝脏中清除 DC加速了肝内纤维炎症和肝脏血管的形成，促进肝纤维化和肝硬化的发生。所以DC在肝纤维化及肝硬化发生发展的过程中主要起抑制作用，而一旦解除这种抑制作用显然会加速肝硬化的形成。
　　Cbl（The Casitas B cell lymphoma）家族蛋白是一类具有Ring-Finger功能结构域的 E3泛素化连接酶，其中Cbl-b和c-Cbl在淋巴细胞的发育和活化中起着重要的作用。Cbl家族蛋白调控T细胞、B细胞的信号转导，影响细胞的发育、活化及免疫耐受的维持。有研究发现c-Cbl参与胸腺的阳性选择和阴性选择，并调控DC的活化；而Cbl-b影响DC信号转导分子的调控。
　　为进一步探讨c-Cbl/Cbl-b是否调控DC的分化发育以及其功能，我们构建了在DC中特异性敲除Cbl-b和c-Cbl的双敲除小鼠（CD11c Cre+c-Cblf/fCbl-b-/-，dKO)、c-Cbl单敲除小鼠（CD11c Cre+c-Cblf/f）、Cbl-b单敲除小鼠（Cbl-b-/-）。我们发现：双敲除小鼠在出生4到7月之间死亡，病理组织切片显示小鼠肝脏出现肝纤维化及肝硬化病变。接着我们对双敲除小鼠肝脏淋巴细胞进行分析后，发现相对于 WT小鼠和Cbl-b或c-Cbl单敲除小鼠，双敲除小鼠中DC细胞比例明显增多，且主要表现为CD103+DC。过继转输dKO小鼠肝脏CD103+ DC给WT小鼠，发现WT小鼠出现轻度肝纤维化。接着我们发现肝脏中DC及CD103+DC活化增强，并且 T细胞呈现活化状态。在将携带抗原的DC与被VSV感染过的WT及dKO小鼠T细胞共培养后，我们发现在双敲除小鼠中DC介导较强的免疫应答反应。实时定量PCR的检测显示DC中IL-1β、IL-6、IL-12细胞因子在双敲除小鼠中表达显著增加。由此可见，Cbl-b/c-Cbl协同作用，参与了DC的分化发育及DC功能，其缺失使DC向CD103+DC发育，并影响了DC对自身抗原递呈，最终导致肝纤维化、肝硬化发生。
　　意义：肝纤维化和肝硬化是目前国内外发病率和致死率较高的一种疑难疾病，本课题从泛素连接酶这一重要的表观遗传学分子入手，从DC对肝脏纤维化和肝硬化这一新颖的角度为突破口，探讨Cbl-b/c-Cbl缺失的DC对肝纤维化和肝硬化这一重要疾病的发病作用和机制。对肝纤维化和肝硬化的病理机制的进一步探讨，不仅从基础理论上提供新的解释，而且更重要的是为临床诊断和治疗提供新的线索。

目录

声明

前言

第一部分 Cbl-b/c-Cbl 双敲除DC小鼠病理分析

一、材料方法

（一）、实验材料

（二）、实验方法

二、实验结果

（一）Cbl-b/c-Cbl双敲除小鼠的生存曲线

（二）Cbl-b/c-Cbl双敲除小鼠肝纤维化和肝硬化的鉴定

三、小结

第二部分 Cbl-b/c-Cbl 双敲除DC小鼠表型分析

一、材料方法

（一）实验材料

（二）实验方法

二、实验结果

（一）双敲除小鼠肝脏中cDC及其亚型的表达情况

（二）双敲除小鼠肝脏pDC的比例及数目

（三）CD103+DC影响小鼠肝脏纤维化

（四）双敲除小鼠肝脏中cDC增殖及凋亡情况

（五）双敲除小鼠肝脏pre-DC的比例

（六）双敲除小鼠肝脏cDC的活化状态

（七）双敲除小鼠肝脏和脾脏中T细胞比例及活化状态

（八）双敲除小鼠肝脏中B细胞比例及活化状态

三、小结

第三部分 Cbl-b/c-Cbl 双敲除对 DC 生物学功能影响的分子机制研究

一、材料方法

（一）实验材料

（二）实验方法

一、实验结果

（一）Cbl-b/c-Cbl 对DC及T细胞免疫功能的影响

（二）CD103+DC 细胞因子表达情况

三、小结

讨论

参考文献

综述:肝硬化中DC调控作用的研究进展

攻读硕士学位期间发表的文章

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致谢