活性维生素D影响卵巢表面上皮细胞自发恶性转化过程中干细胞特性的获得

摘要

目的：
　　上皮型卵巢癌是最为常见的卵巢恶性肿瘤，而且约90％的恶性卵巢肿瘤起源于正常卵巢表面上皮（Ovarian Surface Epithelia,OSE）细胞。本课题组前期成功建立了小鼠卵巢表面上皮（mouse ovarian surfaceepithelial，MOSE）细胞自发恶性转化模型，将不同恶性转化程度的MOSE细胞分为早期（MOSE in early passages, ME：P10-P30）、中期(MOSE in intermediate passages,MI：P31-P80)、晚期(MOSE in late passages,ML：P90-P120)三个阶段。并且发现上皮间质转换（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）和肿瘤干细胞（cancer stem-like cells,CSCs）特性的获得参与卵巢表面上皮细胞的自发恶性转化。经典Wnt通路在人类肿瘤干细胞中的作用已被广泛研究，可以通过调控细胞增殖和自我更新能力维持CSCs的干细胞特性。体内和体外实验研究表明维生素D通过多种方式抑制肿瘤的发生发展，我们前期研究也发现活性维生素D可以抑制人卵巢癌细胞SKOV-3和小鼠卵巢表面上皮细胞的迁移、侵袭能力，长期低剂量处理还可以通过调节EMT延缓小鼠卵巢表面上皮细胞的自发恶性转化进程。维生素D及其类似物可以通过调节Wnt信号通路而影响肿瘤干细胞自我更新等干细胞特性。为了研究活性维生素D长期处理是否影响卵巢癌发生发展过程中肿瘤干细胞特性的获得，本研究使用活性维生素D处理恶性转化早期MOSE细胞至晚期，检测不同恶性转化阶段肿瘤干细胞特性的变化，并且通过体内和体外实验观察活性维生素D对卵巢癌干细胞样细胞生物学特性的影响，初步探讨活性维生素D影响卵巢表面上皮细胞自发恶性转化过程中肿瘤干细胞特性获得的可能机制。为维生素D用于卵巢癌防治提供可靠的实验数据。
　　方法：
　　本研究分为三个部分。
　　（1）分析活性维生素D是否减少恶性转化过程中卵巢表面上皮细胞肿瘤干细胞特性的获得：使用CCK-8实验选择合适的活性维生素D处理浓度，在MOSE细胞体外培养过程中，从MOSE细胞恶性转化早期开始给予活性维生素D处理至恶性转化晚期。平板克隆检测活性维生素D对恶性转化早、中、晚期MOSE细胞增殖能力的影响；分别使用流式细胞仪、Real-time qPCR检测活性维生素D对不同恶性转化阶段MOSE细胞中肿瘤干细胞样细胞的比例和多能干性相关基因表达的影响；使用悬浮球成球率、限制性稀释实验评价活性维生素D是否影响MOSE细胞自我更新能力；X射线辐照后细胞存活率的变化比较对照组和活性维生素D处理组已发生恶性转化MOSE细胞的辐射敏感性。评价活性维生素D是否可以减少卵巢表面上皮细胞恶性转化过程中肿瘤干细胞特性的获得。
　　（2）活性维生素D对小鼠卵巢癌干细胞样细胞生物学特性的影响：使用流式细胞仪分选出卵巢癌干细胞样细胞（CSC-like cells），Real-time qPCR检测活性维生素D对卵巢CSC-like cells多能干性相关基因表达的影响；使用悬浮球成球率和限制性稀释实验检测细胞自我更新能力；分析 X射线照射后，活性维生素D对CSC-like cells辐射敏感性的影响；将对照组和活性维生素D处理组CSC-like cells梯度稀释后接种于裸鼠卵巢被膜下，观察其致瘤能力的变化；从体内和体外实验说明活性维生素D是否影响小鼠卵巢癌干细胞样细胞生物学特性.
　　（3）活性维生素D对VDR/β-catenin通路的影响：Real-time qPCR检测活性维生素D处理自发恶性转化MOSE细胞后，对VDR/β-catenin通路相关基因VDR、β-catenin、CyclinD1及c-Myc表达水平的影响；通过免疫共沉淀技术分析小鼠卵巢癌细胞VDR与β-catenin两者之间的互作关系；同时分析卵巢癌干细胞VDR和β-catenin的表达变化，进一步阐明VDR/β-catenin信号通路在活性维生素D抑制卵巢癌干细胞特性获得的可能机制。
　　结果：
　　1.活性维生素D减少自发恶性转化过程中卵巢表面上皮细胞肿瘤干细胞特性的获得
　　10 nmol/L（nM）活性维生素D长期处理MOSE过程中，发现活性维生素D不仅可以延缓卵巢表面上皮细胞形态由卵圆形转为长梭形，还抑制了三个恶性转化阶段细胞的平板克隆形成率（p<0.05）。说明活性维生素D可以减缓卵巢表面上皮细胞的恶性转化。流式细胞仪检测结果发现，随着MOSE细胞恶性程度的增加，CSCs功能标志物侧群细胞（Side Population，SP）的比例也逐渐增加，活性维生素D可降低不同恶性转化阶段MOSE细胞中SP细胞比例。CD44和CD117是卵巢CSCs表面标志物，已发生恶性转化的MOSE细胞中，活性维生素D也可以抑制CD44+/CD117+细胞比例。说明活性维生素D可以抑制卵巢表面上皮细胞表达肿瘤干细胞功能标志物和表面标志物。Real-time qPCR实验结果显示，随着MOSE细胞自发恶性程度的增加，多能干细胞相关基因NANOG和SOX2的基因表达水平逐渐上升。活性维生素D长期处理可以显著下调NANOG基因表达水平（p<0.05），但是明显上调 SOX2的表达（p<0.05），说明活性维生素D可能通过NANOG基因表达而调节肿瘤干细胞特性的获得。随着自发恶性转化过程的进展，小鼠卵巢表面上皮细胞的自我更新能力也逐渐增加。而活性维生素D长期处理可以显著降低不同恶性转化阶段的小鼠卵巢表面上皮细胞的自我更新能力。细胞存活率实验结果显示，活性维生素D可以增加已发生恶性转化的MOSE细胞对X射线的敏感性。上述结果说明，活性维生素D可以减少自发恶性转化过程中卵巢表面上皮细胞肿瘤干细胞特性的获得。
　　2.活性维生素D对小鼠卵巢癌肿瘤干细胞特性的影响：
　　（1）体外实验检测活性维生素D对卵巢癌干细胞样细胞干性的影响：使用流式细胞仪分离侧群SP细胞代表肿瘤干细胞样细胞和非侧群（non-SP,NSP）细胞代表非肿瘤干细胞样细胞。与已恶性转化的MOSE细胞和NSP细胞相比，SP细胞中多能干性相关基因Notch1、Notch2、KLF4的表达水平均显著升高（p<0.01），与对照组SP细胞相比，活性维生素D可明显下调Notch1和KLF4的转录水平（p<0.05）。说明活性维生素D可能通过下调Notch1和KLF4的转录水平从而抑制SP细胞的干细胞特性。悬浮球形成能力实验检测结果发现，活性维生素D处理组悬浮球成球率明显低于对照组（p<0.05），且悬浮球松散，边缘不整齐。限制性稀释实验的结果显示，活性维生素D明显增加了形成一个肿瘤球所需要的细胞数。说明活性维生素D抑制了卵巢癌干细胞样细胞的自我更新能力。X射线照射结果表明，相同剂量照射下，活性维生素D处理可降低CD44-/CD117-和CD44+/CD117+细胞的存活率（p<0.05），说明活性维生素D不仅可以增加非卵巢癌干细胞样细胞对X射线的敏感性，也增加卵巢癌干细胞样细胞对X射线的敏感性。以上体外实验结果说明，活性维生素D可以降低卵巢癌干细胞样细胞的干性。
　　（2）体内实验检测活性维生素D对CD44+/CD117+细胞致瘤性的影响：裸鼠卵巢原位成瘤实验结果显示，接种104和103个CD44+/CD117+细胞组裸鼠成瘤率达到100%。活性维生素D对其潜伏期、成瘤率等均无明显影响。当接种100个CD44+/CD117+细胞后，对照组和维生素D处理组中成瘤小鼠潜伏期均为35±5天。维生素D组肿瘤发生率为40%，明显低于对照组的100%（p<0.05）。并且发现对照组小鼠除卵巢部位有肿瘤以外，腹腔肠系膜和肝脏上有大量转移瘤，并有血性或黄色腹水产生。而维生素D组成瘤小鼠仅有原位瘤，未发现转移瘤和腹水。体内实验结果说明维生素D不仅可以降低卵巢癌干细胞样细胞的肿瘤发生率，还可以抑制卵巢癌的转移及腹水的产生。
　　3.活性维生素D对VDR/β-catenin通路相关基因表达的影响
　　（1）活性维生素D对卵巢表面上皮细胞恶性转化过程VDR/β-catenin通路相关基因的调控
　　Real-time qPCR实验结果发现，随着MOSE细胞恶性程度的增加，VDR的表达量逐渐上升（p<0.05），活性维生素D处理可下调VDR的表达水平。Wnt通路关键基因β-catenin表达水平在MOSE自发恶性转化过程中无明显改变，但是长期活性维生素D处理可上调β-catenin的转录水平。免疫荧光实验发现随着细胞恶性转化程度的增加，β-catenin逐渐向细胞核聚集。活性维生素D处理虽然上调晚期MOSE细胞中β-catenin总的表达量，但可抑制其由细胞质转入细胞核。为验证VDR与β-catenin之间的关系，使用免疫荧光对恶性转化晚期 MOSE细胞内VDR和β-catenin进行定位分析，发现活性维生素D促进细胞核VDR表达的增加，减少β-catenin从细胞质转移至细胞核。进一步利用免疫共沉淀技术验证这两种蛋白是否直接相互作用，结果发现β-catenin可与VDR直接相互作用。c-Myc和Cyclin D1是Wnt信号通路的下游基因，随着MOSE细胞恶性程度的增加，c-Myc和Cyclin D1的基因表达水平均上升，活性维生素D处理可明显下调c-Myc和Cyclin D1表达，说明活性维生素D可促进VDR与β-catenin结合，进而阻止下游靶基因的激活。
　　（2）活性维生素D对卵巢癌干细胞样细胞VDR和β-catenin基因表达的影响：Real-time qPCR结果发现，与非卵巢癌干细胞样细胞（CD44-/CD117-细胞）相比，卵巢癌干细胞样细胞（CD44+/CD117+细胞）VDR基因表达水平无明显差异，而活性维生素 D处理组 VDR表达水平有上升趋势，但无统计学差异。CD44+/CD117+细胞中β-catenin的表达量高于CD44-/CD117-细胞（p<0.05），活性维生素D有降低CD44+/CD117+细胞中β-catenin表达的趋势（p>0.05）。说明活性维生素D可能通过上调VDR表达水平而抑制β-catenin基因的表达，进而降低卵巢癌干细胞样细胞自我更新能力和裸鼠成瘤能力。
　　结论
　　1.活性维生素D减少恶性转化过程中卵巢表面上皮细胞肿瘤干细胞特性的获得；
　　2.活性维生素D通过降低卵巢癌干细胞样细胞体外自我更新能力、下调干性相关基因Notch1和KLF4的转录水平、增加X射线敏感性，以及降低裸鼠体内致瘤能力和肿瘤恶性程度，抑制肿瘤干细胞生物学特性。
　　3.活性维生素D通过调控VDR/β-catenin通路基因的表达，以及促进VDR与β-catenin的相互作用，进而抑制卵巢表面上皮细胞恶性转化过程中肿瘤干细胞特性的获得。

目录

声明

引言

第一部分 活性维生素D减少卵巢表面上皮细胞恶性转化过程中肿瘤干细胞特性的获得

1 材料与方法

2.结 果

3.讨 论

第二部分 活性维生素D对小鼠卵巢癌干细胞生物学特性的影响

1 材料与方法

2 结 果

3.讨 论

第三部分 VDR/β-catenin通路在活性维生素D抑制卵巢表面上皮细胞恶性转化过程中肿瘤干细胞特性获得的作用

1 材料与方法

2．结 果

3.讨 论

结论

参考文献

综 述：肿瘤干细胞与肿瘤内异质性的关系

研究生期间科研经历及发表文章

中英缩略语对照表

致谢