慢性间歇低氧对小鼠海马CA1区神经元高电压激活钙电流的作用探讨

摘要

目的：建立慢性间歇低氧（chronic intermittent hypoxia, CIH）小鼠模型，观察CIH对小鼠海马CA1区神经元胞膜上高电压激活钙电流及动力学特性的影响，以及L型钙通道亚单位Cav1.3（α1D）表达的改变，探讨高电压激活钙通道在CIH介导神经细胞内钙超载诱导神经认知功能损伤中的作用。
　　方法：ICR雄性小鼠55只，体重20~25g，随机分为常氧对照组（RA+VEH组）15只、慢性间歇低氧组（CIH+VEH组）15只、慢性间歇低氧+尼莫地平干预组（CIH+NIM组）15只和慢性间歇低氧+盐酸美金刚干预组（CIH+MEM组）10只。CIH+VEH组、CIH+NIM组、CIH+MEM组小鼠予间歇低氧环境中（8h/d），RA+VEH组小鼠予常氧环境中，CIH+NIM组、CIH+MEM组小鼠每日间歇低氧前15min，分别腹腔注射尼莫地平注射液（10mg/kg/d）、盐酸美金刚溶液（5mg/kg/d），RA+VEH组和CIH+VEH组小鼠分别腹腔注射等体积酒精溶剂或等量生理盐水。采用脑片全细胞膜片钳技术记录小鼠海马 CA1区神经元胞膜上高电压激活钙电流，绘制钙电流密度-电压曲线、钙通道的激活曲线和稳态失活曲线，Western blot检测小鼠海马组织Cav1.3（α1D）表达改变，分析并比较各实验组之间钙电流密度、钙通道动力学特性以及L型钙通道亚单位Cav1.3表达的差异。
　　结果：
　　一、电生理结果
　　1、脑片全细胞膜片钳记录高电压激活钙电流结果：与RA+VEH组相比，CIH+VEH组海马CA1区神经元胞膜上高电压激活钙通道的电流密度峰值显著升高（RA+VEH：-71.99±9.21pA/pF，n=19 vs CIH+VEH：-135.42±15.41pA/pF，n=25，**p<0.01），而钙通道阻滞剂 NIM干预后降低了高电压激活钙通道的电流密度峰值（ CIH+VEH：-135.42±15.4pA/pF，n=25 vs CIH+NIM：-88.12±9.33pA/pF，n=16，*p<0.05）。同样， NMDAR阻滞剂 MEM也降低了钙电流密度峰值（CIH+VEH：-135.42±15.4pA/pF，n=25 vs CIH+MEM：-46.36±7.21pA/pF，n=11，＃＃p<0.01）。RA+VEH组与CIH+NIM组及与CIH+MEM组之间分别比较，无统计学差异。
　　2、钙电流激活动力学结果：与RA+VEH组相比，CIH+VEH组的钙电流激活曲线发生右移，半激活电压去极化程度升高（ RA+VEH：-22.29±0.88mV， n=19 vs CIH+VEH：-25.39±1.03mV，n=25，*p<0.05），而钙通道阻滞剂NIM干预后，使得钙电流的激活曲线发生左移，半激活电压去极化程度降低（CIH+VEH：-25.39±1.03mV， n=25 vs CIH+NIM：-21.68±1.24mV，n=16，*p<0.05）。同样，NMDAR阻滞剂MEM也使得激活曲线发生左移，半激活电压去极化程度降低（CIH+VEH：-25.39±1.03mV， n=25 vs CIH+MEM：-20.80±1.89mV，n=11，*p<0.05）。以上各组中激活曲线的斜率比较无统计学差异。
　　3、钙电流失活动力学结果：与RA+VEH组相比，CIH+VEH组的钙电流失活曲线发生右移，半失活电压超极化程度降低（ RA+VEH：-23.29±1.55mV， n=10 vs CIH+VEH：-16.38±1.52mV，n=14，**p<0.01），而钙通道阻滞剂NIM干预后，使得钙电流的失活曲线发生左移，半失活电压超极化程度升高（ CIH+VEH：-16.38±1.52mV，n=14 vs CIH+NIM：-20.41±1.12mV，n=12，*p<0.05）。MEM也使得失活曲线呈左移趋势，但半失活电压超极化程度与CIH+VEH组比较无统计学差异。以上各组中失活曲线的斜率比较无统计学差异。RA+VEH组与 CIH+NIM组及与CIH+MEM组之间分别比较，无统计学差异。
　　二、Western Blot检测L型钙通道Cav1.3蛋白表达：
　　与 RA+VEH组比较， CIH+VEH组海马 Cav1.3的表达增加（0.13±0.11 vs0.50±0.09，*p<0.05）。与 CIH+VEH组比较，CIH+NIM组海马 Cav1.3的表达降低（0.45±0.05 vs0.19±0.08，*p<0.05）。
　　结论：CIH诱导小鼠海马CA1区神经元胞膜上高电压激活钙电流显著增加，高电压激活钙通道动力学特征发生改变，L型钙通道蛋白 Cav1.3表达反应性增加，而尼莫地平阻断L型钙通道蛋白Cav1.3表达，降低高电压激活钙电流，减少钙离子内流，逆转海马神经元钙超载，保护海马神经元。结果提示高电压激活钙通道介导的钙离子内流参与了CIH导致的海马CA1区神经元电生理功能损伤过程，为OSAHS学习记忆功能损伤的机制探讨以及进一步的干预治疗，提出了一个值得关注的新靶点。

目录

声明

前言

参考文献

材料和方法

一.试验材料

1．实验动物

2．实验主要仪器、设备

3．实验主要试剂

4．实验主要溶液配制

二.实验方法

1．实验动物与分组

2．小鼠间歇低氧造模

3．脑片膜片钳实验

4．Western blot法检测海马组织中Cav1.3蛋白的表达

三、统计学处理

结果

一、全细胞脑片膜片钳电生理检测结果

1.各组小鼠海马CA1区神经元的HVA钙电流记录

2.各组小鼠海马CA1区神经元HVA钙电流密度的比较

3.各组小鼠海马CA1区神经元HVA钙通道激活动力学的比较

4各组小鼠海马CA1区神经元HVA钙通道失活动力学的比较

二、Western Blot检测各组小鼠海马Cav1.3蛋白表达的变化

讨论

结论

参考文献

综述：电压门控型钙通道与认知功能障碍的研究进展

中英文对照缩略词表

攻读学位期间公开发表的论文及课题

致谢