肥大细胞稳定剂对初诊2型糖尿病患者胰岛功能的影响及机制研究

摘要

第一部分肥大细胞稳定剂对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠胰岛功能的影响
　　目的：随着社会经济的发展和生活水平的提高，糖尿病的发病率在全球范围内正呈上升趋势，而我国大中城市糖尿病患病率亦不断上升。近年来，一些二线城市的糖尿病发病率也不断增加。目前我国糖尿病患者人数约4000万，其中90％以上为2型糖尿病(T2DM)。而长期高糖高脂饮食引起的胰岛素抵抗(IR)正是2型糖尿病的发病关键所在。本研究以高糖高脂饲料喂养联合腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方式，诱导产生2型糖尿病模型大鼠。予肥大细胞稳定剂（酮替芬）灌胃处理，研究酮替芬对链脲佐菌素诱导的糖尿病模型大鼠胰岛功能的影响及其可能作用机制。
　　方法：
　　1.雄性SD大鼠，6-8周，体重160-180g，饲养于温州医学院实验动物中心SPF级环境中。适应性喂养1周后，随机分为正常饲料组16只和高糖高脂饲料组(HF组)20只。
　　2.正常组给予基础饲料喂食，HF组大鼠予高糖高脂饲料喂养。8周后HF组予腹腔注射STZ，空腹血糖值>13 mmol/L，则认为T2DM大鼠模型建立成功。共计16只造模成功。
　　3.成功建立的模型组，再随机分为糖尿病对照组(DM组)和酮替芬治疗糖尿病组(Ketotifen TreatmentDiabetes Mellitus组，KTDM组)。正常饲料组随机分为空白对照组(NC组)和酮替芬药物组(Ketotifen Treatment,KT组)。酮替芬每日用量为0.09mg/kg，空白对照组、糖尿病对照组大鼠用生理盐水代替灌胃。持续8周后全部处死。
　　4.宰杀后留取血液标本，测定空腹血糖（FBG），空腹胰岛素（FINS）,计算胰岛素敏感指数和胰岛素抵抗指数；用ELISA法检测血清中炎症因子白介素-6(IL-6)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。取胰腺组织，测定琥珀酸脱氢酶(SDH)和细胞色素氧化酶(CCO)活性，同时制片在光镜和电镜下观察胰岛的形态变化。
　　5.正态分布的实验结果数据用X-±s表示，用SPSS24.0统计软件进行分析，多组间差异的显著性用单因素方差分析，组间比较采 Student-Newman-Keuls检验进行统计处理。
　　结果：
　　1.酮替芬对糖尿病大鼠空腹血糖和胰岛素水平的影响:与NC组和KT组比较，DM组大鼠空腹血糖、胰岛素水平显著升高（P均<0.01），ISI明显下降而HOMA-IR显著升高（P均<0.01）。酮替芬治疗8周的KTDM组大鼠血糖、胰岛素水平下降，ISI回升、HOMA-IR明显下降，与DM组大鼠比较差别具有统计学意义（P均<0.05），但仍高于NC组和KT组（P均<0.01），说明酮替芬能改善糖尿病大鼠的糖代谢状态和高胰岛素血症，改善胰岛素抵抗，但与正常组相比，尚未能恢复正常。而 NC组和KT组血糖与胰岛素水平比较差别不具有统计学意义（P>0.05），说明酮替芬对正常血糖和胰岛素分泌无影响。
　　2.酮替芬对糖尿病大鼠细胞色素C氧化酶及琥珀酸脱氢酶活性的影响:与NC组和KT组比较，DM组大鼠CCO与SDH活性明显降低（P均<0.05），表明糖尿病大鼠胰腺线粒体功能障碍，处于氧化应激状态。给予酮替芬治疗8周后，上述指标明显回升（P<0.05），提示酮替芬改善胰腺线粒体功能障碍，从而使线粒体功能得到某种程度改善。但与正常组相比较，仍有明显差异（P<0.05）。而NC组和KT组SDH和CCO活性比较差别不具有统计学意义(P>0.05),说明酮替芬对正常大鼠线粒体功能无明显影响。
　　3.酮替芬对糖尿病大鼠血清L-6、TNF-α水平的影响:与NC组和KT组比较，DM大鼠血清L-6、TNF-α水平均明显升高（P<0.01），提示处于炎症状态。酮替芬治疗后，血清IL-6、TNF-α水平降低有明显统计学差异（分别是P<0.01，P<0.05），但与正常对照组比较仍偏高（分别是 P<0.01，P<0.05），表明酮替芬能一定程度改善糖尿病的炎症状态。NC组与KT组无明显统计学差异（P>0.05）。
　　4.光镜下观察：NC组及KT组胰岛细胞表现正常。DM组多数胰岛细胞退行性及坏死性改变，胰岛不规则，结构紊乱，KTDM组经治疗8周后结构恢复良好；
　　5.透射电镜下观察：NC组及KT组β细胞内分泌颗粒丰富，细胞核较大，呈卵圆形，核膜光滑。DM组表现分泌颗粒明显减少，致密芯密度减低，线粒体肿胀，细胞核变形、核膜不光滑，可见内质网扩张。8周后 KTDM组明显改善，分泌颗粒增多，致密芯密度逐渐恢复。
　　结论：酮替芬的干预使IL-6、TNF-α水平明显下降，减轻糖尿病炎症过程，进一步减轻由炎症因子介导的对胰岛细胞线粒体的损伤作用、减少β细胞凋亡和胰岛素抵抗。同时，血糖水平有一定程度的降低，胰岛素敏感性增强，提示胰岛功能改善。光镜、电镜的结果也间接证明了胰岛功能得到了一定程度的恢复，表明这种抗炎症作用对于胰岛细胞的修复过程是十分有利的。
　　第二部分肥大细胞稳定剂对初诊2型糖尿病患者胰岛功能的影响及机制研究
　　目的:
　　探讨肥大细胞稳定剂对初诊2型糖尿病患者胰岛功能的影响及可能机制。
　　方法:
　　选取我院内分泌科初诊2型糖尿病门诊患者32例分实验组和实验对照组，入选标准为：诊断符合1999年WHO关于2型糖尿病的诊断标准；空腹血糖（FBG）≥10 mmol·L-1，糖化血红蛋白（HbA1c）≥10%；年龄18～60岁，体重指数（BMI）在25～30 kg·m-2之间的初诊2型糖尿病患者，实验组以优泌乐25加酮替芬联合降血糖治疗，实验对照组以单纯优泌乐25治疗以控制血糖。选取普通2型糖尿病患者16例作为初始糖尿病对照组，入选标准为：诊断符合1999年WHO关于2型糖尿病的诊断标准；空腹血糖（FBG）在7～10 mmol·L-1之间，糖化血红蛋白（HbA1c）在7～10%之间；年龄18～60岁，体重指数（BMI）在25～30 kg·m-2之间。另外，选取我院体检中心体检人群的16例作为健康对照组。分时间段（0、4、8、12周）进行指标检测：a)评价胰岛功能：患者进行方便面餐试验：禁食8h以上，晨起以75g面饼化于250ml开水内进食。分别于进食前、餐后0.5、1、2和3h这5个时间点取静脉血，检测血糖、胰岛素及C肽水平及其他外周血指标,包括IL-6、IL-1、FFA、血脂、HbA1c、脂联素、白三烯、人类胰蛋白酶、类糜蛋白酶、SOD、MDA等。外周血流式细胞仪检测肥大细胞数目及肥大细胞Toll样受体4（Toll like receptor,TLR4）表达强度变化情况。计算HOMA-IR和HOMA-β,HOMA-IR=（FINS×FPG）/22.5,HOMA-β=（FINS×20）/（FPG-3.5）。并分别测量血压，测量腰围、身高、体重，计算BMI等。
　　结果:
　　1、和正常对照组和普通糖尿病组相比，初诊2型糖尿病患者的血糖、血脂谱、HbA1c水平明显升高（P<0.05）,经治疗后指标明显好转，其中实验组和实验对照组的血糖水平虽然差不多，但实验组治疗后的 HbA1c和实验对照组相比明显降低（P<0.05），而血脂谱的改变治疗效果差不多，没有统计学意义。
　　2、在炎性指标方面，包括IL-6、IL-1β、TNF-α、白三烯、超敏CRP(hs-CRP)，初诊2型糖尿病患者的水平较正常对照组和普通糖尿病组明显升高（P<0.05），经治疗后明显改善（P<0.05），而以实验组改善较实验对照组更为明显（P<0.05）。
　　3、具有抗炎作用的脂联素水平，实验组和实验对照组比正常对照组显著降低（P<0.05），即使跟普通糖尿病组比较，也有很明显的降低（P<0.05），经过治疗以后水平升高，水平开始升高，实验组升高幅度更大一些（P<0.05）。
　　4、在胰岛功能方面，初诊2型糖尿病患者的空腹胰岛素、C肽释放水平均较正常对照组升高（P<0.05），提示存在高胰岛素血症，但餐后胰岛素、C肽释放水平则不能达到正常的释放倍数，经过治疗以后，胰岛功能恢复明显，实验组较实验对照组疗效更佳。
　　5、氧化应激指标方面，实验组和正常对照组及普通糖尿病组比较，超氧化物歧化酶（superoxide dismutaseSOD）水平下降而丙二醛(malondialdehydeMDA)水平升高明显（P<0.05），经过治疗以后，均有较明显恢复。在肥大细胞检测方面，外周血流失细胞检测提示初诊2型糖尿病患者外周血肥大细胞增多，经治疗后有所下降。
　　6、外周血肥大细胞数目及肥大细胞表达的TLR4的强度与血糖水平、炎症指标、氧化应激等密切相关，反应肥大细胞活性的指标，包括类胰蛋白酶和类糜蛋白酶，初诊2型糖尿病患者较正常对照组和普通糖尿病组均有较明显的升高，经过12周治疗以后，这两项指标水平下降明显，实验组较实验对照组更加显著（P<0.05）。
　　结论:
　　1、外周血肥大细胞数目与肥大细胞表达的 TLR4水平与血糖、炎症指标和氧化应激有关。
　　2、初诊2型糖尿病患者胰岛功能由于酮替芬联合胰岛素治疗而改善，而各项炎症、氧化应激指标指标逐渐下降。
　　3、酮替芬可能通过抑制 TLR4信号系统的表达实现抗炎症、抗氧化应激作用，从而保护了胰岛功能。

目录

声明

前言

肿瘤坏死因子（TNF-α）

白细胞介素（IL）

脂联素

C反应蛋白（CRP）

参考文献

第一部分 肥大细胞稳定剂对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠胰岛功能的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 肥大细胞稳定剂对初诊2型糖尿病患者胰岛功能的影响及机制研究

前言

一、对象和方法

二、结 果

三、讨论

参考文献

总结和展望

综述肥大细胞与胰岛素抵抗研究进展

攻读博士专业学位期间发表的论文

缩略语和中英文对照

致谢