A53Tα-Syn和G2019S LRRK2转基因小鼠的PD相关表型及机制分析

摘要

帕金森病(PD)是第二大最常见的神经退行性疾病，其特征在于黑质中多巴胺能神经元的丢失和α-突触核蛋白的错误折叠，可由线粒体功能障碍、氧化应激、兴奋性中毒、细胞凋亡、炎症反应和蛋白酶体紊乱等因素引起。LRRK2和α-Syn中的基因突变可导致家族性的常染色体显性PD。LRRK2与α-Syn之间潜在的病理生理学相互作用目前还不清楚，LRRK2可损害微管动力学、高尔基复合体结构、泛素-蛋白酶体途径，进而间接促使α-Syn的积累和聚集。白藜芦醇具有抗肿瘤、保护心血管、抗炎、抗凋亡、抗氧化、抗自由基等作用，且可以穿过血脑屏障进入大脑，有望成为有效的多巴胺能神经元保护剂，但具体机制有待深入研究。 目的：（1）探究G2019S LRRK2在A53Tα-Syn转基因小鼠体内如何干预α-Syn病理学改变，G2019S LRRK2和A53Tα-Syn基因突变对PD小鼠的症状影响。（2）白藜芦醇对A53T/G2019S双转基因小鼠的保护机制。 方法：（1）分别使用旷场实验、转棒实验、爬杆实验检测WT、A53T HET、G2019S HOMO、G2019S HET、A53T/G2019S 5组基因型小鼠4-18月龄的行为学表现。（2） HPLC-ECD法检测5组基因型小鼠纹状体中的DA、DOPAC、HVA的含量。（3） Western blot法检测5组基因型小鼠纹状体和黑质中P-LRRK2、TH、DAT、VMAT2蛋白表达情况。（4）立体定位注射HSV G2019S构建病毒模型。（5）旷场实验、转棒实验、爬杆实验检测对照组和GS2组的行为表现。（6）IHC法对纹状体及黑质区域做TH染色。（7）Western blot法检测白藜芦醇给药前后A53T/G2019S小鼠的纹状体和黑质中TH、α-Synuclein、DAT、LC3、Nrf2等蛋白表达情况。 结果：（1）我们发现A53T HET、G2019S HOMO、G2019S HET、A53T/G2019S 4组转基因小鼠的运动距离、进入中央格的次数均低于WT组，爬杆用时高于WT组。DA、DOPAC、HVA、TH含量均低于WT组，而DA合成和代谢(DOPAC/DA)、代谢和释放(HVA/DA)的水平高于WT组（2）G2019S HOMO组的行为学表现及DA、DOPAC、TH、DAT、VMAT2含量均低于G2019S HET组，且在5组中行为学表现最差。（3）A53T/G2019S组的行为学表现、DA、DOPAC、HVA、TH、DAT、VMAT2含量低于A53T HET组且在5组中最低，并呈现随龄性降低的趋势，但没有相应地最低的行为学表现，早期死亡率在5组中最高。（4）GS2病毒模型的行为学表现均低于对照组，且黑质中TH神经元丢。失明显，纹状体中DA纤维密度降低。（5）Western blot法显示A53T/G2019S组给药后Beclin1升高、P62降低、LC3-II活化、α-突触核蛋白降解、P-LRRK2降低以及TH、Nrf2和GCLC升高。 结论：（1）A53T HET、G2019S HOMO、G2019S HET、A53T/G2019S 4组转基因小鼠自主活动能力、探索能力和兴奋性、DA和TH含量均低于WT组。（2）G2019S HOMO 组的 PD 症状比 G2019S HET 组明显，表明纯合子致病性更高。（ 3 ） A53T/G2019S组的行为学表现、DA含量和TH含量均低于A53T HET组，且早期死亡率较高，可能是G2019S LRRK2介导的。（4）病毒注射模型有良好的PD症状表现，可以用于以后的实验研究。（5）白藜芦醇一定程度上激活已被抑制的自噬途径，增强抗氧化能力，降低了α-Syn 蛋白的沉积和LRRK2的磷酸化程度，从而缓解A53T/G2019S双转基因小鼠的PD样症状，且优化给药时间和较早鼠龄使用，保护效果可能更好。

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