甲氨蝶呤红细胞载体的制备及在大鼠体内药代动力学研究

摘要

目的：红细胞作为一种新型药物载体，具有良好的生物相容性和可降解性，其在体内较长的循环时间赋予了药物缓释特性，有利于降低药物的毒副作用。载药红细胞表明经特殊处理后，呈现靶向性和缓慢释放的特点，尤其对于某些抗肿瘤药物，可以提高其选择性和治疗效果.本研究通过建立甲氨蝶呤高效液相色谱的测定方法，基于包封率及红细胞形态的改变，摸索和优化甲氨蝶呤红细胞载体的制备条件。比较甲氨蝶呤红细胞载体与普通静脉制剂在大鼠体内药代动力学参数及组织分布，为甲氨蝶呤红细胞载体是否具有临床应用价值提供实验依据。
　　 方法：1.参考文献资料，采用高效液相色沓紫外检测法(HPLC-UV)，以C18为固定相，NaH2PO4溶液-甲醇(72:28)为流动相，调节流动相pH值为5.5，选择阿魏酸作为内标。样品用10％高氯酸沉淀血浆蛋白，使检测不受血浆内源性物质的干扰，峰分离度良好。实验分别建立了大鼠和人血浆中甲氨蝶呤浓度的高效液相色谱的测定方法。
　　 2.甲氨蝶呤红细胞载体的制备：采用高渗法制备红细胞载体，红细胞与葡萄糖混合脱水后，正常的双面凹圆盘状红细胞由于脱水发生皱缩，体积变小，厚度变薄，趋扁平状，部分红细胞由于血红蛋白(Hb)选出变成空泡状。脱水红细胞再置于低渗甲氨蝶呤溶液中重涨，得到甲氨蝶呤红细胞载体(MTX-RBC)，其平均体积增加，趋于球形，体积变异度增大。制备过程中考察红细胞渗透脆性和形态变化，红细胞经脱水体积缩小，细胞内渗透压增高，经低渗甲氨蝶呤溶液膨胀使甲氨蝶呤随渗透压梯度进入细胞内，其中伴随红细胞形态功能的变化。
　　 3.甲氨蝶呤红细胞载体制备工艺的优化：基于红细胞载体包封率对制备工艺进行优化。红细胞载体包封率是指红细胞包载甲氨蝶呤的含量与加入甲氨蝶呤总量的百分比。按照正交表格L9(34)设计，考察不同浓度MTX、全血与高渗葡萄糖比例、脱水时间和药物浸润红细胞时间4个因素在3种不同水平条件下制备的红细胞载体的包封率，由此选定最优制备工艺。
　　 4.采用双周期两制剂交叉实验设计，采集给药后0，5，10，30，60，120，180，240，360，480，600，720，1440min各时间点血样，利用高效液相色谱法测定大鼠血浆中甲氨蝶呤的浓度，应用药代动力学软件DAS1.0计算甲氨蝶呤普通静脉制剂和甲氨蝶呤红细胞载体的药代动力学参数并进行比较，考察MTX-RBC的缓释效应。
　　 5.比较甲氨蝶呤普通静脉制剂和甲氨蝶呤红细胞载体给药后5，30，60，120，180，240，300min时间点在大鼠心、肝、脾、肺、肾、胃、肠各组织的浓度。考察甲氨蝶呤在各组织中的分布特点及载药红细胞是否具有靶向性。
　　 结果：1.血浆中甲氨蝶呤浓度在0.05-5.00μg·ml-1范围内线性关系良好(r=0.9993)，最低检出浓度为20ng·ml-1，日内变异系数为2％-7％，日间变异系数为4％-10％，该方法不受血浆内源性物质的干扰，适合甲氨蝶呤浓度的测定。
　　 2.包封率测定结果表明最优制备条件如下：全血与高渗葡萄糖比例为3:2，脱水时间为40min，MTX浓度为250μg·ml-1，药物浸润红细胞时间为30min，在此条件下制备的MTX-RBC包封率在人红细胞和大鼠红细胞中分别可以达到41.58％和54.69％。
　　 3.红细胞我体制备过程中，红细胞渗透脆性没有发生明显变化，渗透脆性曲线没有发生明显偏移。正常红细胞呈双面凹圆盘状，大小均匀；脱水红细胞呈扁平饼状，细胞体积缩小；MTX-RBC厚度增加，直径变小，有的细胞趋于双面凹圆盘状，有的趋于球形。
　　 4.药代动力学研究显示，普通静脉制剂体内代谢符合三房室模型，而红细胞载体制剂体内代谢符合二房室模型。用非房室的统计矩参数模型拟合得到普通静脉制剂和红细胞载体的Cmax(mg·L-1)分别是13.6±3.7和2.7±1.2，t1/2(h)分别是3.9±0.8和13.5±2.0，AUC0-+∞(mg·L-1·h)分另U是60799.5±11473.8和40583.3±11845.7，MRT0→∞(h)分别是5.7±1.2和19.5±2.9，CL(L·h-1·kg-1)分别是0.27±0.06和0.35±0.07。
　　 5.组织分布实验结果显示两种制剂在各组织中的变化趋势基本相同，但MTX浓度变化不同，在大鼠的肾脏和肝脏中分布较多，5h后各组织中的MTX或其代谢物含量已降至检测限以下。
　　 结论：建立了人和大鼠血浆中及游离甲氨蝶呤浓度的高效液相色谱测定方法，适合甲氨蝶呤红细胞载体相关研究的进行；通过高渗法制备甲氨蝶呤红细胞载体并进行条件优化，发现制备过程是红细胞先经高渗葡萄糖溶液脱水体积缩小，细胞内渗透压增高，再经低渗甲氨蝶呤溶液重涨使甲氨蝶呤随渗透压梯度进入进入细胞内的过程。大鼠体内药代动力学显示甲氨蝶呤经红细胞包载后，其体内峰浓度降低，作用时间延长，表现出良好的缓释特征；组织分布实验显示甲氨蝶呤给药后在肾和肝中浓度较高。通过动物实验表明甲氨蝶呤红细胞载体较甲氨蝶呤普通制剂优，但其临床应用仍具难度。

目录

文摘

英文文摘

前言

声明

第一章 红细胞包载甲氨蝶蝶呤研究进展

1.红细胞药物载体特点

2.红细胞载体的制备

3.红细胞包载抗肿瘤药物的研究

4.结语

第二章 甲氨蝶呤浓度HPLC测定方法的建立

一、人血浆中甲氨蝶呤浓度的HPLC测定方法

1.仪器与试剂

2.测定方法

3.实验结果

4.讨论

二、大鼠血浆中甲氨蝶呤浓度的HPLC测定方法

1.仪器与试剂

2.测定方法

3.实验结果

4.讨论

三、体外游离MTX含量的HPLC测定方法

1.仪器与试剂

2.测定方法

3.实验结果

4.讨论

第三章 甲氨蝶呤红细胞载体的制备

一、高渗法制备红细胞载体

1.实验原理

2.材料与试剂

3.制备方法

二、红细胞载体渗透脆性的研究

1.仪器与试剂

2.方法

3.结果

4.讨论

三、红细胞载体包封率的测定与条件优化

1.仪器与试剂

2.方法

3.结果

4.讨论

四、凝胶层析法测甲氨蝶呤的溢出实验

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

五、高渗法制备红细胞载体过程中红细胞形态研究

1.仪器和材料

2.方法

3.红细胞形态学观察结果

4.讨论

第四章 甲氨蝶呤红细胞载体与甲氨蝶呤普通制剂比较

一、两种剂型在大鼠体内药代动力学比较

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

二、两种剂型药物在大鼠体内的组织分布

1.实验材料

2.动物实验

3.实验结果

4.讨论

第五章 小结

1.甲氨蝶呤浓度HPLC测定方法的建立

2.甲氨蝶呤红细胞载体的制备

3.甲氨蝶呤红细胞载体在大鼠体内药代动力学的研究

4.甲氨蝶呤红细胞载体在大鼠体内组织分布的研究

结论

参考文献

致谢

附录 论文发表情况：