消癌解毒方逆转肺腺癌细胞多药耐药的实验研究

摘要

目的:
　　本研究旨在确定消癌解毒方对肺腺癌细胞多药耐药的逆转作用，寻找出消癌解毒方对多药耐药蛋白的影响，并从分子生物学水平探究消癌解毒方对化疗药物多药耐药的逆转机制。
　　方法:
　　1.选择肺腺癌细胞A549细胞、肺腺癌耐药细胞A549/DDP细胞作为实验细胞，并以流式细胞仪检测细胞表面P-gp、MRP蛋白的表达率。
　　2.以MTT法测定消癌解毒方对A549/DDP细胞的剂量效应曲线，并根据实验结果选取合适的消癌解毒方实验剂量。
　　3.实验分为三组:A549细胞组、A549/DDP细胞组、A549/DDP细胞+消癌解毒方组。以顺铂、氟尿嘧啶、紫杉醇三种化疗药物分别作用于上述三组细胞，应用MTT比色法检测细胞存活率的变化，评价上述三种化疗药物对三组细胞的生长抑制作用，并得出细胞的半数抑制率(IC50)，从而判断化疗药物的敏感性，同时计算出消癌解毒方对肺腺癌耐药细胞的逆转倍数。
　　4.以流式细胞仪检测消癌解毒方对A549/DDP表面P-gp蛋白、MRP蛋白的表达率以及细胞内罗丹明123（Rho123）浓度的影响。
　　5.实时荧光定量PCR检测各组细胞MDR1，MRP基因mRNA水平的变化。
　　6.统计方法:实验数据均采用SPSS17.0软件进行统计学分析:两样本比较采用独立样本t检验分析。多组样本比较采用One-way ANOVA比较各组细胞的差异;如果方差不齐，采用非参数检验比较组间差异，结果以均数±标准差（(x)±s）表示，P≤0.05认为有统计学意义。
　　结果:
　　1.A549细胞及A549/DDP细胞均呈上皮样单层排列，传代周期为3-4天，两种细胞对数生长期存活率均＞95％，形态上A549/DDP细胞与其亲本细胞存在差异，光镜下可见耐药细胞体积略增大，细胞变形，并且多核巨细胞的数量明显增加。A549细胞膜上P-gp蛋白的表达率为68.6％、MRP蛋白的表达率为69.0％; A549/DDP细胞膜上P-gp蛋白的表达率为74.3％，MRP蛋白的表达率为82.6％。
　　2.对DDP、5-FU、Taxol这三种抗癌药，A549/DDP细胞均显示耐药性，其IC50分别为81.30±3.88、199.1±17.91、10.49±1.64，而A549细胞相对敏感，IC50明显下降(P=0.000)，分别为17.68±2.02、63.52±2.09、4.68±1.19。耐药细胞A549/DDP较亲本细胞A549对三种抗癌药的耐药倍数分别为4.60、3.13、2.24。经10mg/ml的消癌解毒方作用后耐药细胞A549/DDP对各抗癌药的敏感性增强，其IC50明显下降(P≤0.001)，分别为34.55±1.01、73.03±12.0、4.61±0.31，其逆转倍数分别为2.35、2.72、2.27。
　　3.A549/DDP细胞经消癌解毒方10mg/ml作用24h后，细胞表面的P-gp、MRP蛋白表达率较作用前下降，由74.3％下降至69.0％，MRP蛋白表达率由82.6％下降至76.5％。
　　4.在Rho123蓄积实验，A549细胞内Rho123荧光很强，表达率为56.5％，而A549/DDP细胞内Rho123荧光很弱，表达率仅为9.6％，加消癌解毒方10mg/ml后，细胞内荧光明显增强，表达率为27.80％，提示消癌解毒方可明显增加耐药细胞对Rho123的蓄积。
　　5.实时荧光定量PCR结果显示，A549/DDP+10mg/ml消癌解毒方组MDR1基因的含量约为A549/DDP组的78.94％，逆转率为21.06％; A549/DDP+10mg/ml消癌解毒方组MRP基因的含量约为A549/DDP组的76.40％，逆转率为20.60％。
　　结论:
　　1.消癌解毒方在体外可明显提高肺腺癌耐药细胞对化疗药物的敏感性;
　　2.消癌解毒方在体外逆转肺腺癌多药耐药的机制可能是通过减少MDR1、MRP基因的表达，从而抑制跨膜转运蛋白的功能，阻止细胞内化疗药物的泵出，增加细胞内化疗药物的浓度，增强对耐药细胞的杀伤作用;
　　3.通过本实验证明消癌解毒方在体外较强的逆转肺腺癌细胞多药耐药性的作用，为迸一步深入进行动物体内实验逆转多药耐药及临床多药耐药逆转提供重要的参考价值。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 理论研究

一、现代医学对肺癌多药耐药的认识

1．1 MDR的定义

1．2 MDR的机制

1．3 肺癌MDR的中药逆转剂

二、消癌解毒方与肺癌治疗

2．1 肺癌的定义

2．2 肺癌的文献阐述

2．3 “癌毒致病”学说

2．4 癌毒致病与肺癌多药耐药的相关性

第二部分 实验研究

第一章 肺癌细胞与肺癌耐药细胞的培养和鉴定

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第二章 消癌解毒方对肺癌耐药细胞的逆转作用

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第三章 消癌解毒方逆转肺癌细胞多药耐药机制的初步探讨

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第三部分 结论

参考文献

攻读硕士学位期间取得的学术成果

致谢