甘草次酸通过内质网应激途径诱导非小细胞肺癌细胞G1期阻滞的作用机制研究

摘要

研究目的：
　　通过观察中药单体甘草次酸对人非小细胞肺癌细胞株A549、NCI-H460的增殖及细胞周期调控的影响，探讨其对人非小细胞肺癌细胞增殖的影响和作用机制，阐述周氏克金岩方中有效成分甘草抗肿瘤的分子生物学基础，从而为临床中医药抗肿瘤治疗提供实验依据。
　　研究方法：
　　1.MTT比色法观察不同浓度甘草次酸(3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM)作用于人非小细胞肺癌细胞株A549、NCI-H46024小时、48小时和72小时，对细胞增殖的影响。
　　2.流式细胞术检测不同浓度甘草次酸（3.125μM、12.5μM、25μM、50μM）作用于人非小细胞肺癌细胞株A549、NCI-H46024小时、48小时及72小时后细胞凋亡及周期的变化。
　　3.Western-Blot测定不同浓度甘草次酸（12.5μM、25μM、50μM）作用于人非小细胞肺癌细胞株A549、NCI-H46024小时对细胞周期相关蛋白CyclinD1、CyclinD3、CyclinE2, CDK2、CDK4、CDK6, p16、p18、p21、p27, pRb、E2F-1及内质网应激相关蛋白Bip、ERP72、PERK蛋白水平影响。
　　研究结果：
　　1.MTT比色法结果表明，甘草次酸对人非小细胞肺癌细胞株A549、NCI-H460的生长具有较强的抑制作用，并在0-50μM浓度范围内具有时间和浓度依赖性。
　　2.流式细胞仪检测显示，经不同浓度甘草次酸作用24、48、72小时，人非小细胞肺癌细胞株A549、NCI-H460细胞周期阻滞在G0/G1期，具有良好的量效关系。
　　3.Western-Blot测定显示，经不同浓度甘草次酸作用24小时后，人非小细胞肺癌细胞株A549、NCI-H460中CyclinD1、CyclinD3、CyclinE2，CDK2、CDK4、CDK6，E2F-1蛋白表达量下降，p16、p18、p21、p27，pRb蛋白表达量升高，Bip、PERK、ERP72未折叠蛋白表达水平升高。
　　研究结论：
　　甘草次酸能明显抑制人非小细胞肺癌细胞株A549、NCI-H460的增殖，诱导非小细胞肺癌细胞周期阻滞于G0/G1期，且能增加A549、NCI-H460细胞p16、p18、p21、p27蛋白的表达、降低Cyclin D1、CyclinD3、CyclinE2，CDK2、CDK4、CDK6蛋白表达，进而抑制Cyclin D-CDK4/6、Cyclin E-CDK2复合物的形成，减少E2F-1蛋白的释放，使pRb保持去磷酸化且结合E2F-1的蛋白状态，使细胞停留在G0/G1期，从而抑制细胞增殖;甘草次酸诱导内质网分子伴侣Bip、ERP72表达增加，活化PERK蛋白，诱导细胞内质网应激反应，激发未折叠蛋白PERK信号通路途径。该研究表明甘草次酸阻滞人非小细胞肺癌细胞株A549、NCI-H460细胞周期于G0/G1期的机制与内质网应激引起未折叠蛋白反应相关，其抑制肿瘤细胞增殖，达到抗肿瘤作用。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 理论研究

第一节 中医对肺癌的认识

1 肺癌古代病名钩稽

2 肺癌病因病机探讨

3 中医治疗肺癌研究进展

第二节 西医学对非小细胞肺癌的治疗

1 概况

2 非小细胞肺癌分子靶向治疗研究进展

第三节 相关信号通路

1 细胞周期信号通路

2 内质网应激

第四节 甘草及甘草次酸抗肿瘤研究进展

第二部分 实验研究

第一节 实验材料

1 细胞株及药物

2 试剂与耗材

3 实验仪器

第二节 实验方法

1 细胞培养

2 实验药品及主要试剂配制

3 MTT法检测细胞增殖

4 流式细胞术检测细胞周期

5 Western-Blot检测细胞蛋白表达

第三节 实验结果

1 GA对A549、H460细胞增殖的影响

2 GA对A549、H460细胞周期的影响

3 GA对A549、H460细胞凋亡相关蛋白表达的影响

4 GA对A549、H460细胞周期调控相关蛋白表达的影响

5 GA对A549、H460细胞BIP、pERK、ERP72蛋白表达的影响

讨论

不足与展望

全文结语

参考文献

附录

攻读硕士学位期间取得的学术成果

致谢