艾灸治疗类风湿关节炎的系统性评价及其治疗机制的蛋白质组学实验研究

摘要

目的:
　　(1)采用系统性评价方法，纳入艾灸治疗类风湿关节炎的随机对照试验，对艾灸干预类风湿关节炎的效果进行全面的评价。
　　(2)借助血清蛋白组学技术，从整体角度探究艾灸干预胶原诱导性关节炎大鼠模型的作用机制。
　　材料和方法:
　　(1)系统性评价研究:所检索的数据库包括了Medline，Embase，CINAHL，the CochraneCentral Register of Controlled Trials，中国生物医学库，中国知网和万方数据库。检索时间从数据库成立最开始的时间到2014年的11月份。符合纳入条件的随机对照试验中，艾灸可以为单独使用，或者与西药联合使用治疗类风湿关节炎。整个系统性评价中，随机对照试验研究的选取，数据提取等过程都是由两位独立的研究者进行的。Cochrane risk of bias工具将被应用于随机对照试验的方法学评价。
　　(2)治疗机制的蛋白质组学实验研究:以36只雄性SD大鼠为研究对象，进行类风湿关节炎造模，造模后随机分为6组，艾灸Ⅰ组，艾灸Ⅱ组，艾灸Ⅲ组，模型Ⅰ组，模型Ⅱ组，模型Ⅲ组，每组各6只。模型组不予治疗，艾灸组在足三里和肾俞穴位上给予艾灸治疗。Ⅰ组观察或干预1周，Ⅱ组观察或干预2周，Ⅲ组观察或干预3周。比较艾灸Ⅲ组、模型Ⅲ组干预前，干预1周、2周、3周的关节炎指数(Arthritis score，AI)。分别采集各组观察或者干预结束后的血清标本。运用二维凝胶电泳结合质谱分析技术，探究和艾灸干预相关的蛋白。利用生物信息学技术，对鉴定的相关蛋白进一步的整合和分析。
　　结果:
　　(1)系统性评价研究:
　　①总有效率(response rate):Meta分析结果提示，和西药治疗相比，艾灸可以有效提高response rate[RR=1.18,95％CI(1.03,1.35), p=0.02; heterogeneity: Chi2=1.11,p=0.77，I2=0％]。此外，与单独的西药治疗相比，艾灸和西药的联用可以提高response rate[RR=1.28,95％CI(1.12,1.47),p=0.0004; heterogeneity: Chi2=1.96,p=0.58，I2=0％]。
　　②美国风湿病学会定义的改善率(Amercan College Rheumatology, ACR):与单独的西药治疗相比，艾灸和西药的联用可以改善ACR50[RR=1.57，95％CI(1.25，1.99)，p=0.0001;heterogeneity:Chi2=2.87，p=0.58，I2=0％]，然而同样的效果并没有在ACR20上发现。
　　③疾病活动度评分(Disease Activity Score28，DAS28): Meta分析结果显示，和单纯西药治疗相比，西药加艾灸的治疗在降低DAS28方面没有明显的统计学意义[MD=-0.45，95％CI(-0.89，-0.01)，p=0.05]，但是具有降低DAS28指数的趋势。
　　(2)治疗机制的蛋白质组学实验研究:
　　①模型Ⅲ组和艾灸Ⅲ组的大鼠在艾灸干预前AI指数并没有明显的统计学差异(p＞0.05)。经过3周的艾灸干预后，与模型Ⅲ组相比，艾灸Ⅲ组的AI指数显著降低且具有统计学意义(p＜0.01）。
　　②艾灸Ⅰ组和模型Ⅰ组之间共鉴定出339个差异蛋白点;艾灸Ⅱ组和模型Ⅱ组之间共鉴定出358个差异蛋白点;艾灸Ⅲ组和模型Ⅲ组之间共鉴定出347个差异蛋白点。三个时间点共同表达的差异蛋白点有17个。在这17个共同表达的差异蛋白中，表达量上调的蛋白有16个，表达量下调的蛋白有1个。
　　③17个和艾灸干预相关的蛋白采用GO分析。一共鉴定出了4个细胞位置，7个分子功能和3个生物学过程。在细胞位置中排前三位的分别是细胞质(62％)，细胞间隙(19％)和其它(13％);在分子功能中排前三位的分别是酶(38％)，其它(25％)和转运载体(13％);在生物学过程中排前三位的分别是代谢过程(56％)，免疫反应(31％)，和细胞反应(13％)。
　　④17个和艾灸干预相关的蛋白采用IPA分析。鉴定出了4个富集度最高的信号通路:Huntington's disease signalling,endothelial nitric oxide synthase(eNOS) signalling,aldosteronesignalling in epithelial cells和unfolded protein response。
　　⑤PRDX1和IP3R作为两个候选蛋白通过ELISA法进行反向验证。和模型组相比，艾灸组可以在干预的第1周，第2周和第3周明显提高PRDX1和IP3R的蛋白表达水平(p＜0.05)。因此，通过本次的ELISA法的反向验证实验，我们可以看出这两个候选蛋白表达量上调的趋势和质谱分析的结果一致，具有较强的可靠性。
　　结论:
　　(1)本次的系统性评价提示艾灸治疗可能给类风湿关节炎患者带来获益。然而，考虑到所纳入随机对照试验研究的样本量较小，偏倚度较高，因此本次系统性评价的阳性结果在解释的时候仍然需要非常小心。
　　(2)艾灸是多靶点，多途径地参与类风湿关节炎大鼠模型治疗过程。同时，我们也发现参与艾灸治疗类风湿关节炎大鼠模型的效应机制不仅包括了病理性的免疫反应，还包括了生理性的代谢过程。此外，PRDX1和IP3R可能作为潜在的靶点蛋白，为解释艾灸治疗CIA大鼠效应机制方面提供了新的思路和依据。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 理论研究

1 现代医学对类风湿关节炎的认识

1．1 类风湿关节炎的概念和流行病学

1．2 病因

1．3 发病机制

1．4 RA的病理变化

1．5 西医对于RA的药物治疗

2 中医学对RA的认识

2．1 病名溯源

2．2 病因病机

2．3 传统中医治疗RA

3 艾灸的理论研究

3．1 艾灸的基本作用机制

3．2 艾灸治疗RA的中医理论基础

3．3 艾灸在RA临床治疗的应用

3．4 艾灸治疗RA的现代机制研究

3．5 艾灸对RA相关信号通路的影晌

4 蛋白组学可以从整体、系统的角度探究艾灸治疗RA的效应机制

第二部分 艾灸治疗类风湿关节炎的系统性评价

1 材料和方法

1．1 系统性评价注册

1．2 检索策略

1．3 文献的选取和纳入排除标准

1．4 数据提取以及文献质量评鉴

1．5 数据分析

2 结果

2．1 文献检索流程和纳入文献特点

2．2 纳入文献质量结果的鉴定

2．3 Meta定量综合分析

2．4 副反应

3 讨论

3．1 与前期相关meta分析的对比

3．2 文献质量学的评鉴

3．3 关于假艾灸安慰剂作用的探讨

3．4 关于艾灸安全作用的探讨

3．5 关于艾灸治疗RA结局指标的探讨

第三部分 艾灸治疗类风湿关节炎机制的蛋白质组学实验研究

1 材料和方法

1．1 材料和仪器

1．2 实验方法

2 结果

2．1 CIA造模结果

2．2 艾灸干预后大鼠一般表现

2．3 艾灸干预后大鼠AI指数变化

2．4 Bradford法蛋白定量

2．5 各组大鼠血清2-DE电泳图谱建立以及差异蛋白的分析

2．6 质谱结果分析

2．7 生物信息学分析

2．8 ELISA反向验证结果

3 讨论

3．1 样本量估算

3．2 动物造模

3．3 取穴依据

3．4 艾灸效果分析

3．5 艾灸调控CIA大鼠的复杂性

3．6 相关鉴定蛋白的生物信息学分析

3．7 相关信号通路分析和蛋白的GO分析

3．8 信号网络图谱分析和验证蛋白的选取

3．9 验证蛋白的生物信息学分析

3．10 艾灸非特异性生理调控作用的探讨

结论

不足与展望

(一)艾灸治疗类风湿关节炎的系统性评价

(二)艾灸治疗类风湿关节炎机制的蛋白质组学实验研究

参考文献

附录

攻读硕士学位期间取得的学术成果

致谢