DDAH/ADMA在类风湿关节炎中的作用及BTM-0512治疗机制研究

摘要

第一章 DDAH/ADMA在胶原诱发的类风湿关节炎中的作用及机制
　　研究背景:
　　类风湿关节炎是最常见的慢性炎症性的自身免疫系统疾病，但其发病机制尚未完全阐明。
　　非对称二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)是内源性一氧化氮合酶的抑制物，除抑制一氧化氮的生成外，还是一种前致炎因子。二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(dimethylargininedimethylaminohydrolase，DDAH)是ADMA的代谢酶。临床研究发现，类风湿关节炎患者血浆中ADMA水平显著升高，且与类风湿关节炎特异性诊断抗体抗瓜氨酸化蛋白抗体呈显著正相关，这提示DDAH/ADMA途径可能参与类风湿关节炎的炎症反应过程。
　　皮质抑素(cortistatin，CST)是新的生长抑素家族成员，具有调节免疫与抗炎作用，是目前研究最多的生长抑素家族成员。研究发现，CST能显著抑制TNF-α生成，并减轻胶原所致关节肿胀和软骨破坏。本实验将在胶原诱发性关节炎大鼠模型和原代培养的大鼠成纤维样滑膜细胞，研究DDAH/ADMA在胶原诱发的类风湿关节炎中的作用，并探讨DDAH/ADMA的效应是否涉及CST途径。
　　方法:
　　采用胶原诱发性关节炎大鼠模型。关节炎指数评分与关节周径及病理评分（苏木精-伊红染色法）以评价组织损伤。收集大鼠血浆用以检测ADMA与炎性因子水平;分离膝关节滑膜与右后踝关节用以检测滑膜组织炎性因子及DDAH与CST的表达。胶原酶消化法分离大鼠成纤维样滑膜细胞，原代培养，分别收集细胞与细胞上清液。酶联免疫吸附法检测血浆与细胞上清液TNF-α、IL-1β及IL-6水平，高效液相色谱检测血浆与细胞上清液ADMA水平。荧光实时定量PCR检测滑膜与细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、DDAH-1、DDAH-2及CST mRNA表达。免疫组织化学法检测滑膜DDAH-2与CST蛋白表达。蛋白质印迹法检测细胞DDAH-1与DDAH-2蛋白表达。免疫细胞荧光法检测细胞CST表达。利用GV230工具载体建立过表达DDAH-2与过表达CST的原代大鼠成纤维样滑膜细胞，以分析DDAH-2与CST的相互作用关系。
　　结果:
　　胶原诱发性关节炎大鼠较正常大鼠关节红肿变形，关节炎指数及病理评分显著高于正常对照组，软骨及骨质破环，血浆和滑膜组织中TNF-α、IL-1β及IL-6水平均显著升高，滑膜组织DDAH-2表达显著下调，而滑膜组织DDAH-1表达和血浆ADMA水平则没有明显变化。CST在胶原诱发性关节炎大鼠滑膜组织中的表达也显著下调。在原代培养的大鼠成纤维样滑膜细胞，TNF-α可时间依赖性升高细胞IL-1β、IL-6及ADMA水平并降低DDAH-2与CST表达，但对DDAH-1表达无明显作用。外源性ADMA处理也可时间与剂量依赖性促进大鼠成纤维样滑膜细胞分泌IL-1β、IL-6，并下调CST表达。过表达DDAH-2能显著抑制TNF-α促IL-1β、IL-6分泌与下调CST表达的作用。过表达CST也可以显著抑制TNF-α促IL-1β、IL-6分泌的作用，但不影响ADMA水平与DDAH-2表达。
　　结论:
　　DDAH/ADMA途径在胶原诱发的类风湿关节炎炎症反应中起重要作用;参与炎症反应的DDAH亚型为DDAH-2而非DDAH-1;DDAH/ADMA的效应与上调抗炎因子CST表达有关。
　　第二章白藜芦醇甲基化衍生物BTM-0512抑制胶原诱发的类风湿关节炎炎症反应及机制
　　研究背景:
　　白藜芦醇是一种天然的多酚类化合物，具有抗炎，抗氧化等多种药理活性。研究发现，白藜芦醇能减轻胶原所致关节肿胀和骨质破坏，但其机制尚未完全明了。
　　(E)-3，5，4'-三甲氧基-1，2-二苯乙烯((E)-3，5，4'-trimethoxystilbene，BTM-0512)为白藜芦醇甲基化衍生物，其稳定性，脂溶性及生物利用度均优于白藜芦醇。文献报道BTM-0512对手术诱发的骨关节炎具有显著治疗作用，但其机制也未阐明。
　　基于我们第一部分研究证明胶原诱发的类风湿关节炎的病理过程涉及DDAH/ADMA/CST途径，以及白藜芦醇和BTM-012能上调DDAH表达，降低ADMA水平。本研究将在胶原诱发性关节炎大鼠模型和原代培养的大鼠成纤维样滑膜细胞，探讨BTM-0512抑制胶原诱发的类风湿关节炎炎症反应的作用及其机制是否涉及DDAH/ADMA/CST途径。
　　方法:
　　建立胶原诱发性关节炎大鼠模型。造模成功后分别给予生理盐水、溶媒（羧甲基纤维素钠）、BTM-0512低/高剂量（20或60 mg/kg·d）、白藜芦醇（60 mg/kg·d）及来氟米特（免疫抑制剂）（6 mg/kg·d）。分别给药处理30天后，以关节炎指数评分与关节周径及病理评分（苏木精-伊红染色法）评价组织损伤。收集大鼠血浆用以检测ADMA与炎性因子水平;分离膝关节滑膜与右后踝关节用以检测滑膜组织炎性因子及DDAH与CST的表达。胶原酶消化法分离大鼠成纤维样滑膜细胞，原代培养，分别收集细胞与细胞上清液。酶联免疫吸附法检测血浆与细胞上清液TNF-α、IL-1β及IL-6水平，高效液相色谱检测血浆与细胞上清液ADMA水平。荧光实时定量PCR检测滑膜与细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、DDAH-1、DDAH-2及CST mRNA表达。免疫组织化学法法检测滑膜DDAH-2与CST蛋白表达。蛋白质印迹法检测细胞DDAH-1与DDAH-2蛋白表达。免疫细胞荧光法检测细胞CST表达。利用siRNA干扰片段建立DDAH-2基因沉默与CST基因沉默的原代大鼠成纤维样滑膜细胞，以分析BTM-0512的作用机制。
　　结果:
　　胶原诱发性关节炎大鼠较正常大鼠关节红肿变形，关节炎指数及病理评分显著高于正常对照组，软骨及骨质破环，血浆和滑膜组织中TNF-α、IL-1β及IL-6水平均显著升高，滑膜组织DDAH-2的表达显著下调，而滑膜组织DDAH-1表达和血浆ADMA水平则没有明显变化，滑膜组织CST表达显著下调。BTM-0512可剂量依赖性抑制胶原诱发性关节炎大鼠关节肿胀和病理改变，降低血浆和滑膜TNF-α、IL-1β及IL-6水平，上调DDAH-2与CST mRNA与蛋白表达。在原代培养的大鼠成纤维样滑膜细胞，BTM-0512能显著抑制TNF-α促IL-1β、IL-6及ADMA分泌，并减弱TNF-α下调DDAH-2与CST表达的作用，但对DDAH-1表达无明显作用;BTM-0512也能显著抑制 ADMA促IL-1β、IL-6分泌并下调CST表达的作用。DDAH-2基因沉默显著降低BTM-0512对TNF-α所致大鼠成纤维样滑膜细胞损伤的保护作用。CST基因沉默显著降低BTM-0512对TNF-α促IL-1β、IL-6分泌的作用，但不影响ADMA水平与DDAH-2的表达。
　　结论:
　　BTM-0512具有抑制胶原诱发的类风湿关节炎炎症反应的作用，其机制与增高DDAH-2活性、降低ADMA水平及上调CST表达有关。