肺纤维化中医治疗数据挖掘及养肺活血方干预机制研究

摘要

肺纤维化是一种多个病因引起的发病机制尚未明确的肺系疾病，其主要病理变化是初期的弥漫性肺泡炎和中后期大量成纤维细胞增殖、转化及细胞外基质、胶原过度积聚，最终发生肺纤维化。肺纤维化的临床特征常见进行性呼吸困难、干咳、气短等。该疾病可由多种肺系疾病发展而来。由于环境污染严重、肺部感染性疾病高发等原因，PF患者有逐年快速增加之势。该病预后较差，被世界卫生组织(WHO)列为难治性疾病。现代西医目前缺乏有效药物治疗肺纤维化，而中医在治疗肺纤维化方面保存了多年治疗的方药和经验，临床上已显示一定的治疗优势，但仍需要进一步的理论研究、临床文献数据挖掘等循证医学及实验研究等数据的支撑。养肺活血方是临床治疗肺纤维化的验方，近年来已通过大量实验研究初步阐述了其作用机制。本课题在梳理、分析古今中西医文献，明确本病中医病因病机特点的基础上，对近10年中医临床治疗肺纤维化的文献进行了数据挖掘，探讨了临床治疗立法组方的基本规律。并依托国家自然基金项目，采用动物实验和细胞实验的方法，进一步观察了养肺活血方对肺纤维化动物模型及体外肺成纤维细胞(MRC-5)激活效应的影响，在分子层面对该方防治肺纤维化的作用机制进行了探讨，其研究结果具有理论指导意义和临床实用价值。 研究目的： 1、对肺纤维化相关古今中西医文献进行较深入的系统分析，明确其中医病名、主要病因病机及治法。 2、对近10年中医临床治疗肺纤维化的文献进行数据挖掘，分析研究其临床有效治法、用药基本规律和组方原则，为临床中医认识和治疗PF提供有效的线索和客观的循证医学参考依据。 3、通过体内动物实验和体外细胞实验，围绕TLR4/NF-κB信号通路，从胶原蛋白COLⅠ、COLⅢ及α-SMA表达、炎症因子等角度，进一步探讨临床验方养肺活血方干预肺纤维化的作用机制。 研究方法： 1、理论研究 在回顾肺纤维化相关古今文献的基础上，对本病的中医病名、病因病机、治疗方法等进行深入、系统的探讨，并从现代医学的角度整理及分析肺纤维化的发病机制。 2、数据挖掘 按照2003年中华医学会呼吸病学分会颁布的肺纤维化诊断标准，收集年限为2005年1月-2014年12月的中国科技期刊全文数据库(CNKI)、中国生物医学文献数据库(CBM)和中国中医文献检索系统数据库(TCM)中医治疗肺纤维相关文献。对符合纳入标准的文献及所涉及的方剂进行研究，利用SPSS统计软件进行频数分析、聚类分析、关联规则分析，探讨肺纤维化中医临床有效治法、用药基本规律和组方原则。 3、实验研究 3.1 动物实验:本课题研究养肺活血方对博莱霉素(BLM)所致PF大鼠模型的影响。设置空白、模型、阳性三个对照组和养肺活血方高、中、低三个剂量组及活血组、养肺组二个拆方组，以Western blot蛋白免疫印迹法检测肺纤维化大鼠COLⅠ、COLⅢ及α-SMA蛋白表达，ELISA法检测肺纤维化大鼠血清IL-13、TGF-β1及IFN-γ含量，Western blot蛋白免疫印迹法检测TLR4及NF-κB蛋白的表达及TLR4/NF-κB信号通路的的活化等。 3.2 细胞实验:观察养肺活血方对TGF-β1诱导的MRC-5细胞纤维化模型的影响。如上设制各实验组，选择DAPT为阳性药物对照组。以Western blot蛋白免疫印迹法检测养肺活血方对TGF-β1诱导MRC-5细胞增殖、α-SMA蛋白表达及TLR4/NF-κB信号通路的影响。 研究结果： 1、理论研究结果:肺纤维化临床以慢性咳嗽、咯痰、胸闷、喘憋等为特点，古代中医文献中没有肺纤维化病名，通过对相关古代文献分析，得出肺纤维化病名应属中医“肺痿”或“肺痹”范畴，早期为肺痹，中期为肺痹、肺痿兼见，后期为肺痿。温邪等诸多原因导致肺中虚热日久、气阴两亏，久则肺络瘀阻，这是肺纤维化的主要病机。临床上，常用中医治法有活血化瘀法、补肺益气法、滋养阴液法、复合治疗法等。同时，对现代医学相关文献进行了综述，分析了本病的主要发病机制等。现代医学认为肺组织损伤、成纤维细胞增生及其表型转化而成肌成纤维细胞、炎症反应和细胞外基质(ECM)积聚，导致了肺纤维化的发生，而转化生长因子-β1(TGF-β1)等一系列细胞因子以及TLR4/NF-κB信号通路等各种信号传导通路，通过组成某种细胞网络参与了PF的发生发展。 2、数据挖掘研究结果: 2.1 常用中药的种类:肺纤维化治疗使用频数高的中药多为益气、活血中药。频次最高的是益气药黄芪(59次)，其次是活血化瘀药丹参(42次)。益气药黄芪、甘草、党参共出现117次，活血化瘀药丹参、当归、川芎，共出现107次。 2.2 用药基本规律:中医临床治疗PF的方剂主要由补益药(占30.68％)、化痰止咳平喘药(占20.26％)、活血化瘀药(占13.47％)、清热药(占12.98％)、利水渗湿药（占3.83％）、平肝熄风药（占3.74％）、理气药（占3.64％）、解表药（占3.44％）、收涩药(占3.15％)9类药物组成。从用药基本规律来看，又以补益药、化痰止咳平喘药、活血化瘀药和清热药为主，累积频率达77.38％。 2.3 病机及治法:肺纤维化以气（阴）虚血瘀病机最多，频数28次，占40.58％;其次为气阴两虚、痰瘀互阻(22次)，占31.88％。故本病病机为气（阴）虚夹瘀或夹痰，以养肺（补益气阴）活血法为主要治则，结合化痰止咳等方法治疗肺纤维化。 2.4 组方配伍规律 2.4.1 组方配伍多用扶正活血之品 药对关联规则分析中发现，益气药黄芪常与当归、川芎、桃仁、三七、红花、丹参等补血活血药配伍，或与破血通络药莪术、水蛭等配伍，体现了补气行血、化瘀通络的治疗思想。其次，益气药黄芪还常与白术、南沙参等健脾补气、滋养肺胃阴液的药物配伍，体现了补气养阴的治疗观点。药组关联规则分析中发现，益气药黄芪在配伍丹参、川芎等活血通络药的同时，往往又配伍党参、当归等补气补血药。表明治疗PF的组方配伍的药物大多选择扶正活血之品。 2.4.2 以补益、清热、活血功效药为主 PF用药的功效归类中使用频次最高的为补益功效药(13频次)，频率为16％，其中使用最多的补益功效药包括黄芪、当归、白术、南沙参、人参、党参等，显示了治疗PF多用补益功效的中药。其次是较多用清热功效(12频次)和活血(10频次)功效药物，频率在12％以上，如有清热功效的生地、甘草等，活血功效的有三七、丹参、川芎等。提示治疗PF以补益、清热、活血功效药为主。 2.4.3 四气多以微温之品配伍寒性和平性药 从用药的四气分析看，大多使用微温之品(12频次)，约占用药频率的52％;寒性药（6频次）和平性药（5频次），频率为22％。既有黄芪、川芎、半夏、陈皮之温，又常用丹参、地龙、黄芩、桑白皮之寒。 2.4.4 五味多以甘味药配伍苦味药和辛味药 以药物的五味而论，甘味药频次最高(14频次)，频率为41％;其次是苦味药和辛味药，酸味药、咸味药及淡味药频次较低。 2.4.5 归经多以肺经药为主，兼配肝脾肾经药 治疗PF归肺经和肝经中药的用药频数(11频次)最多，频率都为18％。提示治疗药物首选治肺之品，肺经药有黄芪、南沙参、人参、百合、百部、杏仁等补肺润肺药，亦有贝母、黄芩、桑白皮、生甘草等清肺之品。其次，归肝经之药有当归、川芎、丹参、白芍、桃仁、三七、红花、莪术、水蛭等，目的在于调理气血、通络化瘀，这是用肝经药“治肝”的核心思想。 3、实验研究结果: 3.1 动物实验结果表明，养肺活血方对博莱霉素诱导大鼠肺纤维化模型有干预作用。给药28天后，肺组织胶原蛋白COLⅠ、COLⅢ及α-SMA的表达均较模型组明显下降，其中又以养肺活血高剂量治疗组效果最为明显，与模型组差异显著(P＜0.05)，提示养肺活血方可以抑制肺纤维化大鼠ECM的沉积、减少肌成纤维细胞的形成。并且，该方还能调控炎症因子，改善肺纤维化大鼠的炎症反应。具体表现在促进IFN-γ分泌，抑制IL-13及TGF-β1生成，提示养肺活血方可以纠正Th1/Th2的失衡，抑制肺纤维化的形成。 3.2 细胞实验结果表明，转化生长因子(TGF-β1)促进细胞增殖，模型组OD值明显增高，而养肺活血方及拆方组OD值均比模型组明显下降（P＜0.01），其中养肺活血高、中剂量组对细胞增殖的增殖抑制率高达50％以上，说明养肺活血方及拆方对MRC-5细胞增殖有抑制作用。 研究结论： 从近10年肺纤维化中医临床用药的文献资料分析结果，认为该病病机与虚、瘀、痰关系最为密切，治疗以益气养阴、养肺化痰、活血通络和养肺清热为主要治法。组方配伍多选择扶正活血之品，功效上多用补益、清热和活血功效的中药。用药多寒温并用，甘味药常配苦味药和辛味药，治疗重心在肺经，兼顾肝脾肾经。 养肺活血方能够缓解博莱霉素致肺纤维化大鼠模型的肺部病变，能够抑制炎症反应、抗胶原合成、调控TLR4/NF-κB信号通路的活化。并且，该方能够抑制体外MRC-5的增殖，可显著降低TLR4及NF-κB蛋白的表达，并能使α-SMA蛋白表达水平降低。因而表明，养肺活血方能够治疗PF，其机制可能与干预TLR4/NF-κB信号通路，抑制成纤维细胞增殖，减轻炎症反应、抑制胶原分泌等有关。

目录

声明

摘要

前言

第一部分理论研究

1中医学对肺纤维化发病机制的认识

1．1肺纤维化的病名和分期

1．2肺纤维化的病因病机

1．3肺纤维化的辨证论治

2现代医学对肺纤维化发病机制的研究

2．1成纤维细胞与PF

2．2炎症反应与PF

2．3细胞因子与PF

2．4信号通路与PF

3养肺活血方的选方用药依据

3．1养肺活血方的组成

3．2养肺活血方的配伍意义

3．3养肺活血方的药理作用

参考文献

第二部分数据挖掘研究

研究一中医临床治疗肺纤维化组方用药规律的文献分析

1文献资料与分析方法

2结果

3讨论

研究二中园临床治疗肺纤维化组方配伍规律的文献分析

1 文献资料与分析方法

2．结果

3讨论

参考文献

第三部分实验研究

实验一养肺活血方对肺纤维化大鼠肺组织α-SMA、COLⅠ、COLⅢ的影响

1 实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

实验二养肺活血方对肺纤维化大鼠血清IFN-γ、IL-13及TGF-β1的影响

1 实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

实验三养肺活血方对肺纤维化大鼠血清MF-κB、TLR4的影响

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

实验四养肺活血方对人胚肺成纤维细胞MRC-5增殖及活化的影响

1、实验材料

2、实验方法

3．实验结果

4．讨论

参考文献

结语

创新点

存在问题与不足

附录

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢

作者简介