益气养阴清热通络方治疗小鼠糖尿病足的作用机制研究

摘要

糖尿病足是全身性疾病，足部溃疡持续时间越长，溃疡并发感染的可能性越大，导致患者截肢的风险越高，因此，如何有效地促进糖尿病足溃疡的愈合是治疗中至关重要的环节。本文以络病理论为指导，提出该病由脾失健运，气阴两伤，瘀热阻络所致，络虚与络瘀并存，主要病位在络脉、肌肉，以“络以通为用”为总治疗原则。益气养阴清热通络方是依据本法为组方原则而创立。本论文通过理论梳理和实验研究，评价该方治疗糖尿病足的疗效，并探讨其可能的作用机理，提升其临床应用价值。 目的:观察益气养阴清热通络方对2型糖尿病所致糖尿病足小鼠模型的治疗作用，探讨糖尿病足可能的发病机制，揭示益气养阴清热通络方治疗糖尿病足的作用机理，为防治该病提供新思路，为临床推广提供科学依据。 方法:选用SPF级C57BL/6J雄性小鼠70只，随机抽取10只为正常对照组，其余小鼠采用高糖高脂饮食喂养联合一次性腹腔快速注射链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）(120mg/kg)、结扎下肢血管的方法，成功构建了2型糖尿病并发糖尿病足的小鼠模型。按随机数字表将符合标准的小鼠分为6组:模型对照组、二甲双胍联合西洛他唑组（西药对照组）、通塞脉片组、益气养阴清热通络方高、中、低剂量组。运用生物化学、光学显微镜、免疫组织化学、三维定量体视学等检测手段及方法，动态观察益气养阴清热通络方对糖尿病足小鼠的一般状态、体重、空腹血糖(Fasting blood glucose，FBG)、创面大小、炎症因子、血管内皮功能、血管新生指标、氧化应激指标、空腹胰岛素(Fasting insulin，FINS)、空腹C-肽(Fasting C-Peptide，FC-P)、胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor1，IGF-1)、胰岛细胞形态与功能等的影响。 结果:(1)益气养阴清热通络方高剂量组、西药对照组小鼠体重均较模型对照组增加（P＜0.05），增加趋势接近正常对照组小鼠的体重。(2)西药对照组、通塞脉片组、益气养阴清热通络方高、中、低剂量组可持续降低FBG，明显低于模型对照组(P＜0.001)，并且低、中、高剂量组之间的血糖有依次下降趋势。(3)西药对照组、益气养阴清热通络方高、中、低剂量组经治疗后，溃疡面积均较模型对照组显著缩小，结痂天数明显缩短，下肢溃疡红肿逐渐消退，跛行、触觉过敏皆有所改善(P＜0.001，P＜0.01或P＜0.05)。(4)益气养阴清热通络方高、中、低剂量组的超敏C反应蛋白（High sensitive C reaction protein，hs-CRP）含量明显降低，高剂量组的白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-a(Tumornecrosis factor-a，TNF-a)、血清血栓素B2(Thromboxane B2，TXB2)、内皮素-1(Endothelin-1，ET-1)含量明显下降（P＜0.001，或P＜0.01），高剂量组的6-酮-前列腺素F-1α(6-Keto-PGF-1α，6-K-PGF-1α)含量明显升高（P＜0.01）。(5)与模型对照组比较，益气养阴清热通络方高剂量组血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)含量明显增加(P＜0.05)。(6)西药对照组、通塞脉片组、益气养阴清热通络方高、中剂量组的小鼠胰腺超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、还原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)含量明显高于模型对照组(P＜0.05，P＜0.01，或P＜0.001)，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量明显低于模型对照组(P＜0.01)。(7)与模型对照组比较，除益气养阴清热通络方低剂量组外，其余各治疗组的FC-P含量明显上升（P＜0.05或P＜0.001）。与益气养阴清热通络方低剂量组比较，通塞脉片组、益气养阴清热通络方高剂量组FC-P含量增加(P＜0.01，或P＜0.001)。(8)与模型对照组比较，西药对照组、益气养阴清热通络方高剂量组IGF-1含量明显上升(P＜0.05)。西药治疗组的FINS水平明显高于模型对照组(P＜0.001)。与益气养阴清热通络方低剂量组比较，西药对照组、益气养阴清热通络方高、中剂量组的FINS含量增加(P＜0.05，或P＜0.001)。(9)与模型对照组比较，各治疗组的胰岛素抵抗指数(Homeostasis model assessment of insulin resistance index，HOMA-IR)水平明显下降(P＜0.001)。(10)苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin，HE)染色、免疫组化染色、三维体视学测量显示:益气养阴清热通络方能延缓小鼠胰岛萎缩，促进胰岛结构及胰岛β细胞的修复，减轻胰岛细胞的病理损伤，调节小鼠全身状态，改善糖尿病足的症状，从而加快足部溃疡的愈合。 结论:(1)益气养阴清热通络方可以调节血糖水平，抑制体重持续下降，良性调节血管内皮功能、抑制炎症因子释放，改善组织缺血缺氧状态，从而促进疮口肉芽组织的生长，缩短溃疡愈合时间，尤其是高剂量组的各项指标的综合改善最为明显。(2)高剂量益气养阴清热通络方可以调节血清VEGF浓度，激活细胞增殖和肉芽组织的生长，促进血管生成，加速足部溃疡愈合;增强胰腺抗氧化应激能力，阻止或延缓胰腺功能的损害。(3)高剂量益气养阴清热通络方能降低胰岛素抵抗，提高胰岛素敏感性，促进胰岛结构及胰岛β细胞的修复，改善胰岛素抵抗和胰岛β细胞凋亡、功能紊乱状态，并且高剂量组的改善情况优于中、低剂量组。(4)高剂量益气养阴清热通络方降糖、缩小溃疡面积、减轻胰岛素抵抗的作用优于通塞脉片，综合改善血管内皮功能、降低炎症因子水平、减轻胰岛体积萎缩、改善小鼠整体状态等方面均优于西药、通塞脉片。 益气养阴清热通络方不仅可以从整体上增强糖尿病足小鼠抗氧化应激的能力，降低胰岛素抵抗，还能从局部上减轻溃疡氧化炎症损伤，改善疮口微环境，共同发挥对糖尿病足的治疗作用，尤以高剂量益气养阴清热通络方的作用为佳。

目录

声明

摘要

前言

1．1病名源流

1．2消渴变证与络病理论的渊源

1．3糖尿病足病因病机

1．4治则治法及组方思路的探微

1．5益气养阴清热通络方的组方分析

2现代医学治疗糖尿病足的研究现状

2．1糖尿病足的定义和流行病学

2．2对早期糖尿病足干预的意义

2．3对糖尿病足发病机制的认识

2．4糖尿病足的诊断

2．5糖尿病足的治疗

第二部分实验研究

1材料与方法

2实验步骤

3数据处理与统计分析

4结果

5讨论

实验二益气养阴清热通络方对糖尿病足小鼠血清炎症因子、血管内皮功能的干预作用

1材料与方法

2数据处理与统计分析

3结果

4讨论

实验三益气养阴清热通络方对糖尿病足小鼠血管新生、胰腺组织氧化应激的干预作用

1材料与方法

2数据处理与统计分析

3结果

4讨论

实验四益气养阴清热通络方对糖尿病足小鼠血清FINS、IGF-1、FC-P及胰岛素抵抗的干预作用

1材料与方法

2数据处理与统计分析

3结果

4讨论

实验五益气养阴清热通络方对糖尿病足小鼠胰岛细胞形态与功能的影响

1材料与方法

2数据处理与统计分析

3结果

4讨论

结语

参考文献

附录

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢

作者简介