连钱草预防草酸钙结石形成及其机制的研究

摘要

研究背景:连钱草，我国有丰富的资源，特别是华北、华东、东北地区。有记载早在两千多年前连钱草已用于尿石病的治疗，臣禹锡等谨按药性论云:连钱草可单用，此草味辛、苦，性属寒，归肝肾、膀胱经，功擅清热解毒，利湿通淋，适用于热淋、石淋、湿热黄疸等症。南京同仁堂开发的“排石颗粒”已经服务国内患者40余年，为2000万结石患者解除了痛苦，其主药就是连钱草，然而目前国内对连钱草预防草酸钙结石的实验研究并不多，本课题从草酸钙结石形成的角度，系统的开展体内、体外研究，探讨连钱草预防草酸钙结石形成的机制。
　　目的:观察连钱草体内、体外预防草酸钙结石形成的作用，探讨连钱草预防草酸钙结石形成的机制。
　　方法:(1)第一部分体外实验，把成核抑制率作为连钱草提取物体外对磷酸钙、草酸钙晶核形成的动力学指标;扫描电镜观察连钱草对草酸钙晶体生长情况的影响;通过检测Zeta电位间接反映晶体间相互排斥情况，观察连钱草对草酸钙晶体聚集能力的影响;通过氧化损伤肾小管上皮细胞膜，激光共聚焦显微镜观察和透明质酸的检测，观察连钱草对草酸钙晶体与肾小管上皮细胞粘附程度的影响。
　　(2)第二部分体内实验，我们通过诱石剂构建大鼠草酸钙动物模型，使用不同浓度的连钱草提取物、枸橼酸钾和排石颗粒在模型构建过程中加以影响，检测大鼠血清钙、磷、钾、肌酐及尿素氮和24h尿尿量、钙、磷、草酸和pH值;通过大鼠肾脏HE染色、冯库萨钙染色，观察肾组织病理损伤及肾脏钙盐沉积情况;通过检测大鼠肾脏超氧化物歧化酶(SOD)、脂质过氧化物-丙二醛(MDA)、过氧化氢酶（CAT）的含量，观察连钱草对肾脏氧化应激损伤的影响;通过检测各组大鼠肾脏骨桥蛋白(OPN) mRNA和蛋白的表达，观察连钱草对大鼠草酸钙结石的预防作用。
　　结果:(1)第一部分体外实验，连钱草组最大诱导时间明显低于空白对照组，晶核形成速率明显高于空白对照组，差异有显著统计学意义(P＜0.01)。1.5g/ml连钱草组最大诱导时间明显低于枸橼酸钾组，晶核形成速率明显高于枸橼酸钾组，差异有统计学意义(P＜0.05);扫描电镜观察，连钱草组草酸钙晶体尺寸变小、橄榄形、圆形、四方体形甚至片状的不规则形晶体增多;不同浓度连钱草组Zeta电位与空白组比较，1.0g/ml和1.5g/ml组明显负值数值增大，差异有显著统计学意义(P＜0.01)，与枸橼酸钾组比较0.5g/ml和1.0g/ml连钱草组Zeta电位数值明显减少，差异有显著统计学意义(P＜0.01);连钱草组草酸钙晶体粘附细胞数量明显减少，细胞状态也较氧化应激损伤组好，对上清液中透明质酸的检测发现连钱草组透明质酸明显低于氧化损伤组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　(2)第二部分体内实验，连钱草和排石颗粒组与空白组比较尿量增多，差异有统计学意义（P＜0.05）;尿草酸排泄水平与空白组比较增加明显，差异有统计学意义（P＜0.05），连钱草组与造模组比较尿草酸含量明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，连钱草和排石颗粒组与枸橼酸钾组比较尿草酸明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）;连钱草组与造模组比较尿枸橼酸含量增多，差异有统计学意义(P＜0.05);尿钙、尿磷排泄量及尿pH值各组比较无统计学差异。连钱草组、排石颗粒组与造模组比较血磷降低，差异有统计学意义（P＜0.05）;0.5g/ml、1.5g/ml连钱草组、排石颗粒组与枸橼酸钾组大鼠比较血肌酐升高明显，差异有统计学意义(P＜0.05)。与对照组比较连钱草组肾脏HE染色发现:近曲小管上皮细胞水肿减轻，小管管腔增大，晶体量少，炎性细胞少。冯库萨钙染色连钱草组:小管管腔增大，晶体量少，乳头管内黑色钙盐沉积明显减少。连钱草组和排石颗粒组与造模组比较SOD活力升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，1.0g/ml、1.5g/ml连钱草组与造模组比较MDA含量明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，0.5g/ml、1.0g/ml和1.5g/ml连钱草组与造模组比较CAT含量升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。造模组OPN mRNA表达最高，1.0g/ml、1.5g/ml连钱草组和排石颗粒组与草酸钙结石造模组比较OPN mRNA表达降低(P＜0.05)，OPN蛋白表达降低，结果与各组OPN mRNA表达情况一致。
　　结论:(1)连钱草体外通过促进磷酸钙、草酸钙晶核形成，抑制草酸钙晶体生长、聚集以及抑制草酸钙晶体与肾小管上皮细胞之间的粘附，预防草酸钙结石形成。
　　(2)连钱草降低了大鼠草酸钙结石动物模型的肾脏氧化应激损伤强度，抑制了OPN的表达水平，有效的预防了大鼠草酸钙结石的形成，其机制可能是通过抑制草酸和草酸钙诱导的肾脏氧化应激损伤而实现。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 理论研究

1 尿石病的中医学认识

1．1 病名沿革

1．2 病因病机

1．3 辨证论治

2 植物药防治尿石病的现代医学研究

2．1 植物药防治草酸钙结石成石过程的研究

3 肾脏的氧化应激与革酸钙结石的形成

3．1 高草酸尿症

3．2 草酸和草酸钙诱导的氧化应激损伤

4 骨桥蛋白与草酸钙结石形成的关系

参考文献

第二部分 实验研究

1 连钱草提取物体外对草酸钙结石晶核形成、晶体生长、晶体聚集以及晶体粘附的影响

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 统计学方法

1．4 结果

1．5 讨论

1．6 结论

2 连钱草提取物对大鼠草酸钙结石动物模型的影响

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 统计学方法

2．4 结果

2．5 讨论

2．6 结论

参考文献

第三部分 总结及展望

1 课题结论

2 创新之处

3 问题与展望

文献综述

英文缩略词表

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢

作者简介