单链莫奈林基因表达载体的构建及其在毕赤氏酵母中的表达

摘要

根据甜蛋白莫标林的氨基酸序列,选择毕赤氏酵母偏爱的密码子,用化学合成法合成单链莫奈林基因片段,并拼接成完整基因.克隆后序列分析表明,合成单链莫标林基因与设计的保持一致.将单链莫标林基因装载到大肠杆菌质粒pUC118、pBSKS+和毕赤氏酵母整合型质粒pPIC9K,构建了毕赤氏酵母单链莫奈林基因表达载体pPCI9K/SCM.利用BglII酶酶切构建好的表达载体pPCI9K/SCM,形成线性化的表达单元,经电转化、RDB缺陷培养和G418抗性平板筛选后,获得了其表达单元整合在酵母基因组中的转化重组子(即重组菌株),其中有3个抗G418的水平达到4mg/ml;转化重组子得到PCR的验证.通过表达测试,得到一个表达水平较高的重组子.经诱导表达,SDS-PAGE显示在约11~12KD处有一条明显的蛋白条带.表达产物纯化后,SDS-PAGE检测发现有两条带,且分子量较大的约为较小的两倍产品;这个结果提示,表达产物在某些溶剂中可能以两种形式——单体和二聚体存在.通过摇瓶诱导发酵,表达产物的含量占发酵上清液总蛋白的46.9﹪,其浓度为2.12mg/ml,产量为11.07mg/g湿菌.经等电薄层凝胶电泳检测,表达产物的pI约为9.4.

目录

摘要

Abstract

第一章文献综述(Literature Review)

1关于甜蛋白莫奈林

1.1植物D.cumminsii简介

1.2莫奈林的物理化学特性

1.3莫奈林的蛋白质结构

1.4莫奈林的甜味活性区域

1.5莫奈林的研究价值

1.6莫奈林的结构改造

2酵母表达系统的简单介绍

3关于毕赤氏酵母(Pichia pastoris)表达系统

3.1毕赤氏酵母表达系统的发展简史

3.2毕赤氏酵母的生物学特点

3.3甲醇代谢

3.4 AOX1启动子

3.5分子遗传操作

3.6表达载体的构建及宿主菌

3.7表达载体的整合

3.8多拷贝的形成

3.9发酵罐下的高细胞密度生长

3.10毕赤氏酵母的密码子用法

3.11外源蛋白的翻译后加工

第二章材料与方法(Materials and Methods)

1.实验材料

2实验方法

第三章结果与分析(Results and analysis)

1单链莫奈林基因的序列分析和鉴定:

2表达载体的构建

3单链莫奈林基因表达单元的整合:

4酵母重组克隆的筛选

5酵母重组克隆的PCR鉴定

6单链莫奈林基因的诱导表达及其表达产物的检测

7表达产物的纯化

8表达产物等电点的测定

9表达产物浓度和产量的测定

第四章讨论(Discussion)

1、研究莫奈林的目的

2、莫奈林在其他生物中的表达

3、毕赤氏酵母表达系统的实验流程

4、密码子的选择

5、表达载体的构建

6、表达载体的整合及鉴定

7、工程菌的诱导表达和表达产物纯化

参考文献：

附录

致谢