猪流行性腹泻病毒SYBR Green I和Taq-Man荧光定量PCR检测方法的建立及应用

摘要

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种高度接触性肠道传染病，主要临床症状是腹泻、呕吐、甚者脱水死亡，各种年龄的猪群都易感，哺乳仔猪的感染率最高，且病死率高，甚者可达100％。现主要的检测方法包括RT-PCR、免疫组化、血清学诊断、病毒分离、电镜检测和ELISA等，但这些方法都存在着敏感性、特异性不高、费时、费工等不足。荧光定量PCR（fluorescent quantitative realtime PCR,qPCR）可以对样品中的病原体的核酸进行快速、准确的定性及定量分析，从而为疾病的早期快速诊断和感染程度的评估，提供高效检测方法。同时，荧光定量PCR也能为病毒复制等基础性研究提供有效手段和工具。
　　为建立SYBR Green I法和Taq-Man法两种检测猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR方法，本试验首先基于PEDV保守区序列，设计了一对检测PEDV特异性引物、一条MGB-Taq-Man（Minor Groove Binder）探针及与之相配套的特异性引物。通过RT-PCR扩增，经克隆测序鉴定，获得了目的片段，制备了标准质粒并建立了对应的荧光定量标准曲线。结果表明所建立的两种荧光定量PCR具有良好特异性，对猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）、猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV）等常见病原体没有交叉扩增反应；两种方法敏感性高，其中SYBR Green I法检测最低病毒含量为103copies/μl，Taq-Man法最低检出含量为10copies/μl。两种qPCR方法重复性好：对检测结果统计学分析表明SYBR Green I荧光定量PCR的批内、批间试验的变异系数分别为0.19%-0.53%和0.3%-2.1%。Taq-Man实时荧光定量PCR的组内变异系数0.03%-0.48%，组间变异系数0.08%-1.2%。运用建立的三种方法检测江西省腹泻仔猪粪便样品中PEDV的感染情况，SYBR Green I荧光定量PCR的检出率92.8%，Taq-Man实时荧光定量PCR的检出率100%，而常规RT-PCR检测方法检出率76.8%，分别高16%和23.2%。
　　以PEDV疫苗株CV777感染Vero-81细胞，于不同的时间间隔收集细胞培养病毒液，利用已经建立好的Taq-Man qPCR对各个时间段的样品进行定量分析，绘制PEDV CV777疫苗株的一步生长曲线。结果表明，接种不同MOI病毒量在一定范围内其复制增殖曲线相似，在感染0-24h内，病毒的RNA含量变化不显著；在24-48h时期内，病毒RNA含量呈指数增加；在48-72h病毒RNA含量增加，但增长速度明显减缓；在72-96h病毒RNA含量基本保持不变，处于相对稳定期，且仍保持较高含量；96-120h病毒RNA含量有下降的趋势，但其病毒RNA含量仍处于较高水平。说明CV777在Vero-81细胞呈S型曲线增长，该方法有利于进一步了解病毒在细胞内的增殖规律，并为野毒的分离、疫苗的生产等奠定基础。

目录

声明

第一章 文献综述

1 PEDV的研究进展

2 本试验的研究目的和意义

1 材料

2 方法

3 结果

4 小结与讨论

第三章 PEDV SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

1 材料

2 方法

3 结果

4 小结与讨论

1 材料

2 方法

3 结果

4 小结与讨论

第五章 应用Taq-Man实时荧光定量PCR探究PEDV疫苗株的培养及增殖规律

1 材料

2 方法

3 结果

4 小结与讨论

全文总结

参考文献

致谢