猪腹泻相关病毒多重和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

摘要

猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)是引发猪病毒性腹泻的主要病原，且三种病原常常混合感染，建立同时检测三种病原的特异性检测方法，在临床诊断上具有重要意义。本研究根据GenBank登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PoRV VP6基因序列保守区设计合成引物，建立了RT-PCR多重快速检测方法。利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PoRV核酸模板进行多重RT-PCR扩增，结果显示:该方法可以同时扩增PEDV S基因(682bp)，TGEV S基因(480bp)和PoRV VP6基因(297bp)的特异性DNA片段，其三对扩增引物对除自身病毒以外的其他两种腹泻病毒及猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明，该多重RT-PCR方法检测灵敏性分别达到PEDV模板3.3×103copies/μL、TGEV模板3.2×103copies/μL和PoRV模板2.8×103copies/μL。用20份临床病料对本研究建立的多重RT-PCR和单一RT-PCR方法进行对比验证，结果显示:两者的总符合率为100％。该PCR反应体系为总体积25μL，Taq酶（5U/μL）0.5μL，引物量(PEDV0.8pmol/μL、TGEV1.0pmol/μL、PoRV1.0pmol/μL)0.5μL，35个循环，总反应时间94min，结果表明，建立的多重RT-PCR检测方法，具有特异、快速、准确的特点，可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。 根据PEDV、TGEV及PoRV的ORF3基因和S基因以及VP7基因，设计的三对特异性引物进行的PCR反应，扩增出的目的片段分别为103bp、115bp和153bp，目的基因和载体pMD18-T连接产物转化到感受态细胞JM-109，提取重组质粒，进行PCR鉴定并测序。重组质粒测OD260并计算其浓度，根据公式进行拷贝数计算。梯度稀释重组质粒制备标准品，分别建立了检测3种病毒的SYBR greenⅠ实时荧光定量PCR方法。建立的PEDV、TGEV及PoRV标准曲线且线性关系良好，相关系数分别为0.992902、0.987219和0.999045，扩增效率分别为0.93、0.99、1.15。特异性试验结果表明，PEDV特异性试验中TGEV、PoRV、PRV、HCV均为阴性;TGEV特异性试验中PRV、PoRV、PEDV、HCV均为阴性;PoRV特异性试验中PRV、PEDV、TGEV、HCV均为阴性;敏感性试验表明，3种病毒SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法的最低检测下限分别为33copies/μL、32copies/μL、28copies/μL;重复性试验结果显示三种检测方法的批内变异系数和批间变异系数均小于5％。说明本实验建立的3种病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的特异性、敏感性和重复性良好。 应用建立的检测方法分别对黑龙江、内蒙等地的20份临床粪便样品进行检测，结果可见PEDV、TGEV及PoRV荧光定量PCR方法检测阳性率分别为70％、50％、35％，单一RT-PCR方法检测阳性率分别为60％、45％、20％。 本研究建立的猪腹泻病毒多重和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法为猪病毒性腹泻的流行病学调查及诊断与防制提供了基础。

目录

声明

摘要

1．前言

1．1 病原概述

1．1．1 猪流行性腹泻病毒

1．1．2 猪传染性胃肠炎病毒

1．1．3 猪轮状病毒

1．2 PEDV、TGEV、PoRV的诊断方法

1．2．1 临床诊断

1．2．2 实验室诊断

1．3 实时荧光定量PCR技术

1．3．1 原理

1．3．2 分类

1．3．3 应用

1．4 研究的目的和意义

2．材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 病毒及临床样品

2．1．2 主要试剂

2．1．3 引物设计与合成

2．1．4 病料样品的处理

2．1．5 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 单一病原体基因PCR扩增及测序

2．2．2 多重RT-PCR扩增

2．2．3 PCR产物的回收

2．2．4 目的基因片段与pMD18-T载体的连接

2．2．5 大肠杆菌JM-109感受态的制备

2．2．6 连接产物的转化

2．2．7 pMD18-T基因重组质粒的鉴定

2．2．8 测序及结果分析

2．2．9 多重PCR扩增条件的优化

2．2．10 特异性试验

2．2．11 敏感性试验

2．2．12 重复性试验

2．2．13 临床感染病料的检测

2．2．14 荧光定量PCR标准品的制备及标准曲线的建立

2．2．15 荧光定量PCR的特异性

2．2．16 荧光定量PCR的重复性

2．2．17 荧光定量PCR的敏感性

2．2．18 荧光定量PCR临床样品检测

3 结果与分析

3．1 多重PCR扩增条件的优化结果

3．1．1 单一RT-PCR扩增及退火温度的优化结果

3．1．2 多重RT-PCR引物浓度的优化结果

3．1．3 多重RT-PCR循环数的优化结果

3．2 特异性试验结果

3．3 敏感性试验结果

3．4 重复性试验结果

3．5 临床样品的检测

3．6 荧光定量PCR扩增目的片段电泳结果

3．7 重组质粒测序结果

3．8 荧光定量PCR标准曲线

3．9 荧光定量PCR重复性试验结果

3．10 荧光定量PCR溶解曲线分析结果

3．11 荧光定量PCR特异性试验结果

3．12 荧光定量PCR临床样品检测结果

4 讨论

4．1 多重RT-PCR方法检测猪腹泻病毒

4．2 检测猪腹泻病毒的荧光定量PCR方法分析

5 结论

5．1 建立了检测PEDV、TGEV、PoRV的多重PCR方法

5．2 建立了检测PEDV、TGEV、PoRV荧光定量PCR方法

5．3 临床样品的检测

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文