甜菊苷的定向转化及产物甜茶苷的分离纯化

摘要

甜菊糖是从甜叶菊(Stevia rebaudiana bertoni)中提取的一种天然甜味剂,主要成分为甜菊苷(SS)和莱鲍迪甙A(RA)。甜茶苷(RS)是从高山植物甜茶中提取出来的天然甜味剂,产量低且受地域条件的限制,如果能用生物转化的方法将SS转化为RS,可为RS的生产提供全新的方法,减少因种植甜茶而带来的山地生态破坏。
　　 本工作筛选了一株能特异性转化甜菊苷为甜茶苷的细菌。结合菌体、菌落的形态特征及16S rDNA序列鉴定,确定其为黄杆菌(Chryseobacterium sp.,专利保藏号为CCTCC NO:M209202)。该菌能专一性对SS进行转化,而不作用于甜菊糖中的其他成分。
　　 经单因素试验,优化了该菌的培养条件,结果表明,木薯淀粉1％,蛋白胨1％,K2HPO40.5％,KH2PO40.5％,NaCl0.2％,硫酸镁0.04％是适宜的培养基成分,在pH7.0,37℃,50 mL/250mL,接种量10％的条件下,48 h可将10 mg/mL甜菊糖溶液中的甜菊苷(7.2 mg/mL)完全转化。
　　 该菌所产酶为胞内酶,采用高压破壁,在45℃,pH值7.0,底物浓度10 mg/mL的条件下,12 h甜菊苷的转化率为95％,15 h可完全转化。用不同的表面活性剂对细胞进行破壁,当SDS添加量0.2％,12h转化率为90％,CTAB添加量1％时,12h转化率为74％,Triton-100添加2％,12 h转化率达到100％。
　　 以海藻酸钠为包埋材料,对黄杆菌胞内酶进行固定化,在海藻酸钠浓度4％,氯化钙浓度2％,经2 h的固定化,然后在45℃,pH7.0,在10 mL1％甜菊糖溶液中添加15 g固定化酶,固定化酶可重复利用3次,转化效率保持在80％以上。
　　 用大孔树脂对RS进行分离纯化,研究表明,1体积的CN-308树脂可以完全吸附10倍体积转化液中的糖分。上样液为27.5BV时,RS与RA吸附饱和。用70％乙醇作为洗脱剂,洗脱液体积为1.5BV时,RS纯度为96％.