hsBAFF通过Ca2+-CaMKII信号转导激活mTOR通路促进B淋巴细胞增殖机理研究

摘要

本研究运用细胞培养、流式细胞仪、Western bloting等细胞学分子生物学技术,通过离体和在体实验,选用胞内钙离子鳌合剂BAPTA/AM、胞外钙离子鳌合剂]EGTA、内质网IP3R抑制剂2-APB、CaMKII特异性抑制剂KN93以及mTOR特异性抑制剂雷帕霉素,综合研究和观察了hsBAFF刺激B淋巴细胞增殖与升高的[Ca2+]i的关系,探讨了hsBAFF通过Ca2+-CaMKII信号转导激活]mTOR通路在促进B淋巴细胞增殖中的作用及其分子机理,为hsBAFF有效地发挥免疫调节作用提供新思路和理论依据。
　　具体结果如下:1hsBAFF上调[Ca2+]i激活mTOR信号通路促进B淋巴细胞增殖机理研究采用抗CD-19磁珠分离纯化鼠脾脏B淋巴细胞。细胞悬液接种于6孔培养板(2×106/孔)或96孔培养板(2×104/孔)在37℃,含5％CO2培养箱培养。第2天,用2.5、5μg/ml hsBAFF和/或2.5μg/ml anti-IgM刺激B淋巴细胞12h或0-24h、或在BAPTA/AM、EGTA或2-APB预处理1h后,用5μg/ml hBAFF和/或2.5μg/ml anti-IgM刺激B淋巴细胞12h。选用荧光探针Fluo-3/AM通过流式细胞仪分析或荧光比色法检测细胞内Ca2+荧光强度、MTT法分析B淋巴细胞增殖、Western blot分析Akt、S6K1、S6、4E-BP1蛋白磷酸化表现。我们显示:hBAFF或hsBAFF+anti-IgM共刺激B淋巴细胞以剂量和时间依赖方式呈现明显[Ca2+]i升高;用BAPTA/AM螫合胞内Ca2+确认hsBAFF升高[Ca2+]i激活Akt/mTOR通路导致B淋巴细胞的增殖;用EGTA或2-APB减少胞内Ca2+表明hsBAFF可以通过增加胞外Ca2+内流和内质网Ca2+释放经激活Akt/mTOR通路导致B淋巴细胞增殖。提示:hsBAFF可能诱导胞外ca2+内流和内质网ca2+释放与[Ca2+]i升高有关,进而激活mTOR信号通路促进B淋巴细胞的增殖。2hsBAFF诱导CaMKII磷酸化激活mTOR通路促进B淋巴细胞增殖机理研究采用抗CD19磁珠分离纯化鼠脾脏B淋巴细胞。细胞悬液接种于6孔(2×106/孔)或96孔培养板(2×104/孔)在37℃,含5％CO2培养箱培养。第2天,用hsBAFF(1-10μg/ml或5μg/ml)和/或anti-IgM(2.5μg/ml)刺激B淋巴细胞12h或0-24h、或在BAPTA/AM、EGTA、2-APB或KN93预处理1h后,用5μg/ml hBAFF和/或2.5μg/ml anti-IgM刺激B淋巴细胞12h。Western blot分析CaMKⅡ、 Akt、S6K1、S6、4E-BP1蛋白磷酸化表达,MTT法分析B淋巴细胞增殖表现。结果显示:hsBAFF以浓度依赖和时间依赖的方式诱导B淋巴细胞CaMKⅡ磷酸化;BAPTA/AM、EGTA、2-APB预处理明显抑制hsBAFF刺激或联合anti-IgM共刺激的B淋巴细胞CaMKⅡ磷酸化增加,用CaMKⅡ特异抑制剂KN93预处理,观察到KN93明显抑制hsBAFF刺激或联合anti-IgM共刺激的B淋巴细胞CaMKⅡ、Akt、mTOR介导的S6K1和4E-BP1磷酸化以及细胞增殖增加。
　　提示:hsBAFF升高[Ca2+]i关联CaMKⅡ磷酸化,激活mTOR信号通路促进了B淋巴细胞增殖。3hsBAFF通过钙信号转导激活mTOR通路促进B淋巴细胞增殖体内实验及雷帕霉素调控研究选用40只健康ICR小鼠,雌雄各半,随机分成1个对照组和4个不同剂量的hsBAFF处理组,每组8只。处理组每日腹腔注射含hsBAFF0.1、0.5、1和2mg/kg体重的PBS溶液,对照组注射同等剂量的PBS溶液。整个实验期8天,之后用抗CD19磁珠分离纯化脾脏B淋巴细胞,接种于6孔培养板(2×106/孔)或96孔培养板(2×104/孔)在37℃,含5％CO2培养箱培养。另取正常健康小鼠脾脏分离纯化B淋巴细胞,接种于6孔培养板培养,在雷帕霉素预处理2h后,用5μg/ml hBAFF和/或2.5μg/ml anti-IgM刺激B淋巴细胞12h。选用荧光探针Fluo-3/AM通过荧光比色法检测细胞内Ca2+荧光强度、MTT法分析B淋巴细胞增殖、Western blot分析CaMKⅡ、Akt、S6K1、S6、4E-BP1蛋白磷酸化表现。
　　我们观察到:hsBAFF注射小鼠8天后,脾脏B淋巴细胞增殖活性呈现剂量依赖地升高,并且可见[Ca2+]i水平以及B淋巴细胞CaMKⅡ磷酸和Akt、mTOR介导的S6K1、4E-BP1磷酸化也呈hsBAFF剂量依赖增加。我们发现,雷帕霉素预处理明显抑制hsBAFF刺激或联合anti-IgM共刺激的B淋巴细胞[Ca2+]i升高以及CaMKⅡ磷酸化增加。提示:hsBAFF注射小鼠脾脏B淋巴细胞激活增殖与Ca2+-CaMKⅡ信号转导激活mTOR通路有关;雷帕霉素可以抑制hsBAFF诱导[Ca2+]i升高和CaMKⅡ的磷酸化。

目录

摘要

summary

引言

第一部分 文献综述

第一章 B淋巴细胞与免疫的关系

1 B淋巴细胞增殖与分化

2 B淋巴细胞表面受体

3 B淋巴细胞与免疫疾病的关系

参考文献

第二章 BAFF激活B淋巴细胞及其信号转导机理进展

1 BAFF的分布及结构

2 BAFF激活B淋巴细胞的作用

3 hsBAFF激活B淋巴细胞信号转导调控机理

参考文献

第二部分 实验研究

第三章 hsBAFF升高[Ca~(2+)]_i激活mTOR通路促进B淋巴细胞增殖机理研究

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

Abstract

第四章 hsBAFF诱导CaMKⅡ磷酸化激活mTOR通路促进B淋巴细胞增殖机理研究

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

Abstract

第五章 hsBAFF通过钙信号转导激活mTOR通路促进B淋巴细胞增殖体内实验及雷帕霉素调控研究

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

Abstract

第三部分 全文结论

全文结论

致谢

附1