白氏文昌鱼COMMD4基因克隆及免疫功能的分析

摘要

COMMD蛋白是最近发现的一类蛋白家族，因其羧基末端具有高度保守的由70-85个氨基酸构成的独特的结构域——COMM结构域(copper metabolismgene MURR1 domain)而命名。目前，COMMD蛋白家族有十个成员，即COMMD1-COMMD10，这十个成员皆存在COMM结构域，有研究表明，此结构域可以结合其他因子如Cu12等，并且似乎在抑制NF-κB方面起关键作用。目前，除了COMMD1外，其他COMMD蛋白的特征及其功能了解的都较少。文昌鱼属于脊索动物门头索动物亚门，是介于无脊椎动物和脊椎动物的过渡物种，一直被认为是研究脊椎动物起源和进化的模式生物。随着弗罗里达文昌鱼基因组测序的完成，关于文昌鱼的免疫研究将成为研究的热点。
　　本研究中，我们在白氏文昌鱼中克隆得到了具有完整编码框的白氏文昌鱼COMMD4基因，其全长1008bp，是由一个含有603个核苷酸的开放阅读框（ORF）、一个11个核苷酸的5'UTR和一个含有多聚腺苷酸信号(AATAAA)的394个核苷酸的3' UTR组成，其开放阅读框编码一个由200个氨基酸组成的蛋白质，其羧基端含有该家族特有的典型COMM结构域（第130-198位残基），预测其理论相对分子质量为22kDa，其理论等电点(pI)为5.81。白氏文昌鱼COMMD4蛋白与已经实验验证的其他物种COMMD4蛋白的一致性和相似性分别为38.8％-64.0％，55.5％-82.5％。利用白氏文昌鱼COMMD4蛋白的氨基酸序列与其他典型物种的COMMD蛋白的氨基酸序列进行系统发生树分析发现，白氏文昌鱼COMMD4蛋白与其他物种的COMMD4蛋白聚为一簇，而与其他COMMD蛋白明显分开。而白氏文昌鱼COMMD4蛋白与其他物种COMMD4蛋白的氨基酸序列进行系统发生树分析，结果表明，白氏文昌鱼COMMD4蛋白处于脊索动物的最底部，这与经典分类法相一致。文昌鱼COMMD4基因的基因组序列分析表明，在其基因组序列中只有一个外显子，这和海鞘的COMMD4基因相同，但与海胆、果蝇和其他脊椎动物不同，在海胆和脊椎动物中，内含子的增加和保留可能在一定程度上与其功能有关，但并不清楚在海鞘和文昌鱼中的COMMD4基因的6个内含子缺失这一现象的产生，是因为后移还是因为同源重组。在八个物种中的10个COMMD蛋白家族成员的保守性分析表明，不同物种含有不同的COMMD蛋白家族成员。其中，脊椎动物均含有十个COMMD蛋白家族成员，而文昌鱼缺少COMMD1蛋白，这表明文昌鱼可能存在着COMMD1基因的二次丢失，并且这些基因的缺失可能是由不完整的基因组组装引起的。白氏文昌鱼COMMD4基因的mRNA在五个组织中均表达，但性腺内表达量最高;白氏文昌鱼COMMD4基因mRNA的表达受LPS的刺激，其表达情况为先增加后减少（分别在6h和12h时达到最高值和最低值），然后在48h后恢复。综上所述，本研究首次在白氏文昌鱼中证实了COMMD4基因的存在，并为COMMD蛋白家族的先天免疫及进化研究提供了依据。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 文昌鱼的概况

1．1．1 文昌鱼的形态结构

1．1．2 文昌鱼的生活习性

1．1．3 文昌鱼的在我国的分布及分类

1．1．4 文昌鱼的价值意义

1．1．5 文昌鱼的研究现状

1．2 COMMD蛋白家族的研究进展

1．2．1 COMMD蛋白家族概况

1．2．2 COMMD蛋白功能研究进展

1．3 本研究目的与意义

1．4 本研究技术路线

1．4．1 白氏文昌鱼COMMD4基因的克隆

1．4．2 白氏文昌鱼COMMD4基因功能的研究路线

第二章 白氏文昌鱼COMMD4基因的克隆

2．1 实验材料与仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 白氏文昌鱼COMMD4基因cDNA及DNA全序列的克隆

2．3 结果与分析

2．3．1 白氏文昌鱼总RNA的提取

2．3．2 白氏文昌鱼COMMD4基因部分片段的克隆

2．3．3 COMMD4基因全长的扩增

2．4 讨论

第三章 白氏文昌鱼COMMD4基因的生物信息学分析

3．1 实验使用的生物软件

3．2 实验方法

3．2．1 COMMD4基因功能位点及结构分析

3．2．2 COMMD4蛋白序列比对及结构分析

3．2．3 COMMD4基因的系统发生分析及COMMD蛋白家族十个成员不同物种间的系统发生分析

3．3 结果与分析

3．3．1 白氏文昌鱼COMMD4基因理化性质分析及结构分析

3．3．2 白氏文昌鱼COMMD4蛋白的氨基酸序列的同源性比对分析

3．3．3 COMMD蛋白家族在不同物种间的保守性

3．3．4 不同物种的COMMD4蛋白及COMMD蛋白家族各个成员蛋白的比对分析和系统发生树

3．4 讨论

第四章 白氏文昌鱼COMMD4基因抗菌功能的初步鉴定

4．1 实验材料与实验仪器

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 LPS刺激对白氏文昌鱼COMMD4基因表达量的影响

4．2．2 不同组织白氏文昌鱼COMMD4基因的表达量情况

4．2．3 统计学分析

4．3 结果与分析

4．3．1 LPS刺激下不同时间点白氏文昌鱼CONMD4基因表达情况的分析

4．3．1 不同组织白氏文昌鱼COMMD4基因表达情况的分析

4．4 讨论

总结

参考文献

附录

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢