白氏文昌鱼Amphip38基因克隆及免疫功能的分析

摘要

丝裂酶原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)级联反应是细胞内重要的信号传导系统之一。p38MAPKs是MAPK家族中的重要成员，被认为是细胞众多信号转导通路的中转站。MAPK的激活需要双位点磷酸化，p38亚家族的所有成员都具有“T-G-Y”双位点磷酸化模块。通过上游的MKK3和MKK6磷酸化TGY模块而激活p38蛋白。磷酸化的P38再激活一些转录因子和其他的蛋白酶后可导致许多生物学效应的发生，参与细胞存活、分化和凋亡等过程，在炎症、应激反应中也有重要作用。文昌鱼是脊索动物中的基底生物，是研究无脊椎动物过渡到脊椎动物的模式动物，文昌鱼在生物进化中的特殊地位，能够为研究脊椎动物p38MAPKs信号通路以及免疫系统的进化提供关键的证据。本论文以白氏文昌鱼p38为研究对象，通过基因克隆、实时定量PCR、免疫印迹、生物信息分析等技术手段得到以下的研究结果:
　　(1)本研究采用RACE技术克隆了白氏文昌鱼p38基因全长，命名为Arnphip38。其cDNA序列全长为1329bp，其中5'UTR为88bp，3'UTR为131bp，ORF长为1110bp。Amphip38的ORF编码了369个氨基酸，包含一个高度保守的STK（丝氨酸/苏氨酸激酶）结构域。预测蛋白分子量为42 kDa，等电点为5.52。
　　(2)通过蛋白序列的同源性分析，Amphip38与其他物种的p38蛋白氨基酸序列有较高的相似性(80.5％-84％)和一致性(67.2％-72.5％)。Amphip38与脊椎动物鲈鱼(Dicentrarchus labrax)的Mapk14有最高一致性为72.5％。由此可以确认Amphip38是脊椎动物p38的同源基因。
　　(3)同源性分析可见p38蛋白在动物中较保守，通过p38蛋白一级结构氨基酸序列的分析，在p38蛋白中STK结构域是非常保守的。TGY模块、CD模块，ATP结合环(ATP binding loop)、 ED位点、底物结合位点(substratebinding site)，这些保守的位点对p38蛋白行使功能有重要的作用。我们进一步预测了p38蛋白的三级结构，发现Amphip38与其他物种的p38蛋白结构非常相似，呈马鞍形状，蛋白表面有一个重要的凹槽，凹槽中有p38蛋白重要的结构-“磷酸化唇”，TGY motif就在这个区域，是p38的激活位点。Docking site，CDsite，ED site在Amphip38蛋白空间结构中都位于蛋白三维结构表面，这可能与p38蛋白与底物的结合有关。
　　(4)将白氏文昌鱼Amphip38蛋白和其他物种p38蛋白进行比对并构建系统发生树，结果表明:白氏文昌鱼Amphip38基因的进化地位位于无脊椎动物与脊椎动物之间，与脊椎动物更为亲近。另外，p38家族在从无脊椎动物到脊椎动物进化过程中可能发生了基因重复或分化，导致生成了四个亚型(p38α、p38β、p38γ和p38δ)。
　　(5)利用实时荧光定量PCR检测发现，Amphip38在五个组织中都广泛表达，但表达量有差异:Amphip38在脊索与肌肉中表达量丰富，在肝盲囊表达量适中，在肠与鳃中较低。在脊索和肌肉中的高表达量可能与p38的组织特异性功能有关，在肌肉和脊索中可能主要参与细胞的增值、分化的调控，由于肝盲囊是脊椎动物肝脏的前体组织，在肝盲囊中较高的表达可能与文昌鱼的免疫炎症反应有关。
　　(6)采用实时荧光定量PCR检测LPS刺激后在不同时间点(2h，4h，6h，8h，12h，24 h)文昌鱼Amphip38基因的表达量变化，在4h和6h出现了显著升高，并且在6h上升到最高。此变化初步证明了白氏文昌鱼Amphip38基因参与先天免疫应答。
　　(7)利用western blot技术检测LPS注射后0.5h和1h，p38蛋白的磷酸化水平明显增多，而在注射后的3h和6h下降。在蛋白水平上进一步证实了Amphip38蛋白与哺乳动物p38蛋白有相同的功能机制，通过磷酸化激活参与文昌鱼的先天免疫应答。
　　总之，我们首次克隆了Amphip38基因并研究分析了Amphip38蛋白的结构与功能。我们的结果表明，Amphip38在白氏文昌鱼中参与先天免疫应激反应的调节。Amphip38基因是脊椎动物的祖先基因。我们当前的研究可为先天免疫机制的研究以及p38家族的进化提供有价值的信息。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 文昌鱼概况

1．1．1 身体结构

1．1．2 生活方式

1．1．3 头索动物在进化中的作用

1．1．4 文昌鱼的研究近况

1．2 p38的研究进展

1．2．1 MAPK家族研究进展

1．2．2 p38家族的研究进展

1．2．3 p38研究近况

1．3 论文研究的意义

1．4 论文的创新点

1．5 技术路线

第2章 白氏文昌鱼p38基因的克隆

2．1 实验材料、试剂与仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 提取文昌鱼总RNA

2．2．2 反转录获取cDNA模板

2．2．3 p38基因编码区中间片段的克隆

2．2．4 RACE法扩增白氏文昌鱼p38基因cDNA全长

2．2．2 白氏文昌鱼Amphip38基因的序列分析

2．2．2 同源性分新

2．2．3 序列比对

2．2．4 Amphip38蛋白三级结构分析

2．2．5 p38基因家族的进化分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 白氏文昌鱼Amphip38基因全长的克隆

2．3．2 Amphip38基因的序列分析

2．3．3 Amphip38蛋白同源性分析

2．3．4 Amphip38蛋白氨基酸序列的分析

2．3．5 Amphip38蛋白三级结构的分析

2．3．6 p38基因家族的进化分析

第3章 白氏文昌鱼Amphip38基因在组织中的分布情况分析

3．1．实验材料与仪器

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验试剂

3．1．3 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 解剖白氏文昌鱼获取分离组织

3．2．2 获取组织总cDNA

3．2．3 实时荧光定量PCR

3．3 实验结果与讨论

第4章 白氏文昌鱼Amphip38免疫应激功能

4．1 实验试剂与仪器

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验试剂

4．1．3 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 实时荧光定量PCR

4．2．2 Western blot免疫印迹

4．3 实验结果与讨论

4．3．1 LPS刺激下Amphip38基因表达量变化分析

4．3．2 LPS刺激激活Amphip38蛋白

研究总结与展望

附录

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢