灰盖鬼伞内切几丁质酶和内切葡聚糖酶基因的克隆及表达研究

摘要

大型伞菌子实体菌柄细胞壁的伸长机制目前还不清楚，其作用机理目前主要流行的是水解酶作用学说，认为水解酶的降解作用使细胞壁松弛扩张，从而引起菌柄细胞壁的伸长生长;还有一些学者认为菌柄细胞壁生长不需要水解酶的参与，提出菌柄细胞壁的伸长生长由多聚糖链的滑动及几丁质链的被动移动造成的，其中多聚糖链的爬行滑动是由膨压介导产生的持续破坏和葡聚糖链之间氢键重排导致的。近期本实验从蜗牛胃液中分离纯化了一种expansion-like蛋白，能使加热灭活的金针菇菌柄细胞壁伸长，并且没有水解活性;我们提出菌柄细胞壁的伸长机制与植物细胞壁的伸长相似，可能是由一种内源的Expansin-like蛋白介导的通过打破葡聚糖链或几丁质链之间的氢键，促进细胞壁多聚糖链的滑动，从而造成菌柄细胞壁的伸长。因此，本研究试图克隆重组表达灰盖鬼伞的几丁质酶和葡聚糖酶，以便获得重组表达的纯化细胞壁多糖水解酶，排除内源性杂酶的干扰，研究这些多糖水解酶在担子菌菌柄细胞壁伸长中的作用机制。 本论文分析了灰盖鬼伞的内切几丁质酶(CC1G_05285.3 endochitinase)基因的信号肽序列，首次克隆出它的cDNA序列，构建了其克隆载体和原核表达载体，并在大肠杆菌表达系统中进行异源重组表达，结果显示，内切几丁质酶基因在大肠杆菌系统中有可溶性重组蛋白表达，但没有检测到水解酶活性;可能是由于原核表达系统缺少糖基化的修饰。 本论文同时对灰盖鬼伞内切葡聚糖酶（CC1G_12388.3 endoglucanase-4）进行了研究，也分析了其信号肽序列，构建了它的克隆载体和原核表达载体，但原核异源重组表达显示内切葡聚糖基因没有在大肠杆菌系统中成功表达;对内切葡聚糖酶基因相对于大肠杆菌表达系统的稀有密码子情况进行了分析，发现其稀有密码子数量都超过了基因密码子总数的7％，其中脯氨酸稀有密码子CCC多达23个，占其稀有密码子总数一半以上;此外其3'端末尾有连续的精氨酸稀有密码子AGG出现，所以我们推测大肠杆菌表达系统中稀有密码子产生的密码子偏好性导致内切葡聚糖酶不能成功表达。 因此我们构建了这两种水解酶的酵母真核表达载体，尝试在真核表达系统中进行重组表达，以期获得重组表达的内切几丁质酶和内葡聚糖酶，有关研究正在进行之中。

目录

声明

摘要

第一章 前言

一、真菌细胞壁结构的研究进展

二、真菌菌柄细胞壁伸长的研究进展

三、真菌几丁质酶和内切葡聚糖酶的异源重组研究概况

1．真菌几丁质酶的异源重组研究进展

2．真菌内切葡聚糖酶的异源重组研究进展

3．大肠杆菌表达系统

4．酵母表达系统

四、本论文的研究目的及意义

第二章 灰盖鬼伞内切几丁质酶基因的克隆及表达

第一节 灰盖鬼伞内切几丁质酶基因的克隆

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

第二节 灰盖鬼伞内切几丁质酶的原核异源重组表达

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

第三节 灰盖鬼伞内切几丁质酶的真核异源重组表达菌株的构建

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

第三章 灰盖鬼伞内切葡聚糖酶基因的克隆及表达

第一节 灰盖鬼伞内切葡聚糖酶基因的克隆

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

第二节 灰盖鬼伞内切葡聚糖酶的原核异源重组表达

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

第三节 灰盖鬼伞内切葡聚糖酶稀有密码子分析

第四节 灰盖鬼伞内切葡聚糖酶的真核异源重组表达菌株的构建

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

总结

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢