文昌鱼microRNA及其合成代谢相关蛋白的识别、鉴定及比较基因组分析

摘要

文昌鱼是现存与脊椎动物亲缘关系较近的物种，被誉为研究脊椎动物起源和进化的“活化石”。microRNA(简称miRNA)是一类与转录后基因沉默相关的长度为21～25nt内源性的非编码小RNA，在精细调控基因表达及生物生长发育方面发挥着重要作用。目前，文昌鱼miRNA研究仍处于初级阶段，数据库中报道的文昌鱼miRNA数量仍然有限。因此，本论文进一步利用生物信息学方法系统开展了文昌鱼miRNA及其合成代谢相关蛋白的识别、鉴定与比较基因组学研究，得到以下重要的研究结果: 1.利用生物信息学技术及RNAfold软件和Triplet-SVM算法，对佛罗里达文昌鱼基因组中新的miRNA进行鉴定，最终获得了245个佛罗里达文昌鱼miRNA，其中183个miRNA为新鉴定的基因。基因组定位分析发现，scaffold211上连续分布了9个成簇存在的miRNA，EST表达分析暗示着这些miRNA是表达的。物种间同源miRNA比较发现，相比较于其他无脊椎动物，文昌鱼与脊椎动物具有更高的同源性。对预测的52个佛罗里达文昌鱼miRNA家族比较发现，这些保守的miRNA家族分布具有物种/家族特异性。比较不同物种间miRNA家族类型和拷贝数，发现文昌鱼miRNA家族经历了一个基因扩增的转变阶段，且发现无脊椎动物中miRNA家族多以单拷贝的形式存在。对佛罗里达文昌鱼不同发育阶段miRNA表达谱分析，发现仅有19个miRNA在佛罗里达文昌鱼发育阶段广泛表达，绝大多数miRNA具有发育阶段表达特异性。文昌鱼miRNA靶基因鉴定及功能注释，发现miRNA靶基因功能主要涉及细胞粘着分子活性、分子伴侣、防御或免疫蛋白活性、催化及酶调节活性等。另外，预测的靶基因中发现有79个基因为之前文章中报道的免疫相关基因，推测佛罗里达文昌鱼部分miRNA可能与文昌鱼的免疫作用有关。 2.利用生物信息学方法从白氏文昌鱼（Branchiostoma belcheri）Solexa高通量测序数据中鉴定miRNA基因，总计获得了483个白氏文昌鱼miRNA，其中287个为新鉴定的白氏文昌鱼miRNA。进一步鉴定miRNA的前体序列，总计获得了238个miRNA前体序列。基因组定位分析发现，304个miRNA匹配86个scaffold，每个scaffold上分布的miRNA的数目从1～25不等，scaffold22连续分布了25个成簇的miRNA。11个miRNA能匹配基因组多个位置，存在多拷贝的现象，暗示着基因组重复事件的发生。保守性分析结果显示，58.39％预测的白氏文昌鱼miRNA能横跨1～89个物种间保守（E值≤10-5），白氏文昌鱼miRNA与已知的121个(64.71％)佛罗里达文昌鱼miRNA高度相似。预测的白氏文昌鱼miRNA可以分为70个家族，其中99％白氏文昌鱼miRNA家族在佛罗里达文昌鱼中保守。70个白氏文昌鱼miRNA家族具有物种/家族特异性，其中有39个(55.71％) miRNA家族属于文昌鱼属特有，这些物种特异性的miRNA家族的存在对于进化的独特性将起到一定的作用。比较不同物种间miRNA家族类型和拷贝数，发现不同的物种miRNA家族类型和拷贝数存在差异，miRNA基因数量随着生物个体复杂性的增加，在基因组进化过程中呈现不断扩张的趋势。对不同物种中miRNA前体序列中重复序列分析结果显示，相对于人和海鞘，文昌鱼miRNA前体序列中分布重复序列较少，暗示着重复元件对文昌鱼miRNA在进化过程中的扩增并未产生多大的影响。 3.利用同源搜索及生物信息学方法在文昌鱼、海鞘、七鳃鳗及紫海胆的基因组中搜索参与miRNA合成代谢相关蛋白。利用最新版本GENSCAN和GeneWise软件预测基因结构，进一步拼接出基因的全长或部分cDNA序列。通过RT-PCR实验及EST表达分析进一步验证了预测的可靠性。保守结构域分析结果显示，同一基因家族的大部分蛋白具有相同或相似的结构域，在文昌鱼和小鼠Drosha蛋白中预测出两个独特的结构域YppG和Drf FH1结构域。不同物种间蛋白基因的同源性比较发现，相对于海鞘，文昌鱼与脊椎动物中各蛋白具有较高的相似性。EST表达分析显示佛罗里达文昌鱼和玻璃海鞘中的各蛋白基因具有发育阶段表达特异性。使用MEME软件预测蛋白基序，结果获得了Drosha和Dicer蛋白5个高保守的基序，AGO和Piwi蛋白10个保守的基序，AGO蛋白的基序中包含了一个三联体的催化位点“D-D/G-H/R”，Piwi蛋白中包含“D-D-H/K/R”催化位点。基因结构比较发现，脊椎动物与无脊椎动物之间各蛋白家族基因外显子数目之间存在差异，哺乳动物Drosha蛋白一般含有30个外显子，而昆虫只有3～11个外显子，文昌鱼与脊椎动物之间基因结构较相似。通过比较各蛋白基因平均外显子和内含子长度发现，昆虫和线虫Drosha和Dicer蛋白基因平均外显子的长度要大于平均内含子的长度，但人、斑马鱼等物种却相反，文昌鱼和海鞘与脊椎动物基因结构相似。系统进化分析结果显示，所有的Piwi蛋白可以分为两个簇，其中一个簇包含人的PIWIL1、PIWIL3和PIWIL4及相关的同源基因，另一个簇包含人PIWIL2及相关的同源基因。进化压力分析结果显示， Dicer基因中存在着大量的正选择位点，这些正选择位点的存在对Dicer基因的结构和功能的变化起到了非常关键的作用。 以上的研究结果为更深入理解文昌鱼miRNA及其合成代谢相关蛋白的功能、揭示文昌鱼自身的生命活动规律以及揭示脊椎动物起源和演化机制提供了重要的理论基础，对更进一步研究文昌鱼功能基因组学具有重要的理论意义和实践价值。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 miRNA的研究进展

1．1．1 miRNA的简介

1．1．2 miRNA的产生

1．1．3 miRNA的作用机制及功能

1．1．4 miRNA的进化

1．1．5 miRNA的研究方法

1．2 参与miRNA产生及功能行使的相关核心蛋白的研究进展

1．2．1 RNase Ⅲ型蛋白家族

1．2．2 Argonaute蛋白家族

1．2．3 Exportin 5蛋白家族

1．3 文昌鱼miRNA的研究进展

1．3．1 文昌鱼的概括及研究现状

1．3．2 文昌鱼miRNA的研究进展

1．4 本论文研究的目的及意义

1．5 本论文的创新点

1．6 本论文的技术路线

第二章 佛罗里达文昌鱼基因组中miRNA预测及家族进化分析

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 数据的采集

2．2．2 佛罗里达文昌鱼基因组中miRNA预测的流程

2．2．3 佛罗里达文昌鱼miRNA基因组定位及成簇分析

2．2．4 佛罗里达文昌鱼miRNA保守性及家族进化分析

2．2．5 佛罗里达文昌鱼miRNA靶基因预测及基因功能注释

2．2．6 佛罗里达文昌鱼miRNA不同发育阶段的EST表达分析

2．3 结果

2．3．1 佛罗里达文昌鱼基因组中miRNA的鉴定

2．3．2 佛罗里达文昌鱼miRNA的基因组特征分析

2．3．3 佛罗里达文昌鱼miRNA的保守性及家族进化分析

2．3．4 佛罗里达文昌鱼miRNA的靶基因预测及功能分析

2．3．5 佛罗里达文昌鱼不同发育阶段miRNA的EST表达分析

2．4 讨论

第三章 白氏文昌鱼(Branchiostoma belcheri)miRNA的识别及特征分析

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 数据来源

3．2．2 白氏文昌鱼miRNA的鉴定及特征分析

3．2．3 白氏文昌鱼miRNA二级结构预测及基因组定位分析

3．2．4 白氏文昌鱼miRNA的保守性及家族进化分析

3．3 结果

3．3．1 白氏文昌鱼Solexa数据miRNA的鉴定

3．3．2 白氏文昌鱼miRNA二级结构预测及基因组定位分析

3．3．3 白氏文昌鱼miRNA的保守性及家族进化分析

3．4 讨论

第四章 文昌鱼miRNA合成代谢相关蛋白的生物信息学预测及特征分析

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 数据搜集

4．2．2 同源基因的鉴定

4．2．3 结构域和基序分析

4．2．4 基因结构特征分析

4．2．5 RT-PCR验证和测序

4．2．6 EST表达分析

4．2．7 序列比对与系统发育分析

4．2．8 选择压力分析

4．3 结果

4．3．1 miRNA合成代谢相关蛋白的鉴定

4．3．2 RT-PCR实验验证及EST丰度分析

4．3．3 miRNA合成代谢相关蛋白的结构域、基序以及催化残基分析

4．3．4 miRNA合成代谢相关蛋白的基因结构分析

4．3．5 系统进化分析与自然选择压力分析

4．4 讨论

第五章 结论

附录

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢