超高压致大肠杆菌O157:H7损伤后的修复机理研究

摘要

超高压技术作为一种非热杀菌技术，已成为控制食品中大肠杆菌O157∶H7等食源性致病菌的有效手段。然而，研究发现超高压处理可导致细菌产生亚致死损伤，由于菌体特性改变导致其在常规检测中易被低估或忽视，故亚致死损伤菌的存在给食品的安全及货架期带来潜在风险。前入较多研究超高压对微生物的致死效应，而对超高压诱导微生物损伤后的修复研究少见报道，因此本论文旨在研究超高压损伤的大肠杆菌O157∶H7在无营养的磷酸盐缓冲液PBS中的修复情况。本论文首先采用不同压强对大肠杆菌O157∶H7进行超高压处理，确定出产生损伤菌较多的超高压条件，接着对此条件下所产生的损伤菌以PBS为基质于不同温度下进行修复，确定亚致死损伤菌的最佳修复条件;进而，在最佳修复条件下研究修复过程中损伤菌形态结构变化、生理特征分析、基因表达的变化等来阐明大肠杆菌O157∶H7超高压损伤后的修复机理。本研究将为实际生产加工中超高压的科学合理使用提供依据，为超高压处理后的安全贮藏提供风险评估手段。具体研究内容和结果如下:
　　1、损伤的大肠杆菌O157∶H7不同温度下的修复曲线
　　大肠杆菌O157∶H7分别采用100、200、300、400、500 MPa(25℃、5 min)进行超高压处理，采用选择性培养基SMAC和非选择性培养基TSA进行传统培养计数，结果表明，随着压强升高，灭活效果越好，但是损伤效应与致死效应并不一致。大肠杆菌O157∶H7在400 MPa条件下处理5 min，亚致死损伤率最高。进一步将400 MPa超高压处理后的大肠杆菌O157∶H7分别置于20、25、30、37℃下，以PBS作为基质进行修复研究，结果表明随着修复时间延长，损伤菌分别在60h(20℃)、24h(25℃)、36h(30℃)、48 h(37℃)基本修复，最终确定损伤的大肠杆菌O157∶H7的最适修复温度为25℃，修复24 h时基本完成修复。
　　2、损伤的大肠杆菌O157∶H7修复过程中形态结构变化
　　在上述实验基础上，400 MPa超高压损伤的大肠杆菌O157∶H7在无营养基质PBS中25℃修复24 h，采用扫描电镜和透射电镜观察超高压损伤菌在不同修复阶段下表面形态和内部结构的变化。扫描电镜结果表明，超高压可导致菌体表面凹陷、细胞膜破裂、变形等形态异常，但随着修复时间延长，损伤菌表面逐渐变光滑，修复18h、24 h后菌体形态显著改善，最终基本恢复为正常菌。透射电镜结果表明，超高压可导致菌体细胞变形、质壁分离、细胞内出现光透明区、细胞膜破裂等变化，但随着修复时间延长，细胞质分布均匀，透明区域逐渐消失，至实验末期损伤菌的结构基本恢复为正常菌。
　　3、损伤的大肠杆菌O157∶H7修复过程中生理特性的变化
　　400 MPa超高压损伤的大肠杆菌O157∶H7在PBS中25℃修复24 h，研究超高压损伤菌在不同修复阶段下Na+、K+、Ca2+、Mg2+离子外泄量、细胞膜Na+K+-ATP酶活性和Ca2+Mg2+-ATP酶活性、细胞膜通透性、可溶性膜蛋白组成及膜脂肪酸组成等生理特性方面的变化。结果表明，超高压处理可对大肠杆菌O157∶H7细胞膜生理特性造成严重破坏，各指标与未经超高压处理的对照组相比均具有显著性差异(P＜0.05)。修复过程中，随着修复时间延长，各离子外泄量、Na+K+-ATP酶和Ca2+Mg2+-ATP酶活性、细胞膜通透性、可溶性蛋白组成、脂肪酸组成的变化逐渐趋向正常细胞水平，表明损伤的菌体生理特性发生修复。实验末期修复24 h时与正常未处理组仍存在显著性差异(P＜0.05)，这主要与体系中存在一定量不可逆损伤和死亡细菌有关。
　　4、损伤的大肠杆菌O157∶H7修复过程中差异基因的表达
　　采用Real-time PCR相对定量的方法分析400 MPa超高压诱导大肠杆菌O157∶H7损伤后修复过程中热休克蛋白相关基因DnaK、GroEL、ClpP、ClpA表达量变化。结果表明，超高压处理后四种热休克蛋白相关基因DnaK、GroEL、ClpP、ClpA表达量均显著上升(p＜0.05)，修复过程中四种基因表达量仍逐渐上升，且修复后期显著高于修复初期(p＜0.05)，进一步证实超高压处理后，热休克蛋白在增强细胞对外界有害刺激的自我保护和加速细胞自我修复方面的关键作用。

目录

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摘要

缩写表

图表索引

第1章 绪论

1．1 大肠杆菌O157：H7与食品安全

1．1．1 大肠杆菌O157：H7生物学特征

1．1．2 大肠杆菌O157：H7的流行病学研究

1．1．3 大肠杆菌O157：H7的致病机制

1．1．4 大肠杆菌O157：H7在食品中污染情况

1．2 食品超高压加工技术的概述

1．2．1 超高压杀菌的基本原理

1．2．2 超高压食品加工技术的特点

1．2．3 超高压抑制微生物的影响因素

1．2．4 超高压对微生物的影响机制

1．2．5 超高压杀菌技术在食品中应用现状

1．3 微生物损伤及损伤后修复研究

1．3．1 微生物亚致死损伤研究

1．3．2 损伤后修复方法研究

1．3．3 损伤后修复机理研究

1．4 存在问题和本研究的意义

1．5 本课题技术路线图

第2章 损伤的大肠杆菌O157：H7不同温度下的修复曲线

2．1 材料与方法

2．1．1 菌种与试剂

2．1．2 仪器与设备

2．1．3 实验方法

2．1．4 统计分析

2．2 结果与分析

2．2．1 超高压对大肠杆菌O157：H7的抑制结果

2．2．2 超高压处理后损伤菌的修复曲线

2．3 讨论

2．4 本章小结

第3章 损伤的大肠杆菌O157：H7修复过程中形态结构变化

3．1 材料与方法

3．1．1 菌种与试剂

3．1．2 仪器与设备

3．1．3 实验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 不同修复时间下扫描电镜检测的细菌形态特征

3．2．2 不同修复时间下透射电镜检测的细菌结构特征

3．3 讨论

3．4 本章小结

第4章 损伤的大肠杆菌O157：H7修复过程中生理特性变化

4．1 材料与方法

4．1．1 菌种与试剂

4．1．2 仪器与设备

4．1．3 实验方法

4．1．4 统计分析

4．2 结果与分析

4．2．1 Na+、K+、Mg2+、Ca2+离子外泄的检测

4．2．2 Na+K+-ATP酶、Ca2+Mg2+-ATP酶活性的检测

4．2．3 大肠杆菌O157：H7膜通透性的变化

4．2．4 大肠杆菌O157：H7可溶性膜蛋白组成的变化

4．2．5 大肠杆菌O157：H7膜脂肪酸组成的变化

4．3 讨论

4．4 本章小结

第5章 损伤的大肠杆菌O157：H7修复过程中差异基因表达

5．1 材料与方法

5．1．1 菌种与试剂

5．1．2 仪器与设备

5．1．3 实验方法

5．1．4 统计分析

5．2 结果与分析

5．3 讨论

5．4 本章小结

全文结论

论文创新点

工作展望

参考文献

致谢